RNA在病原微生物检测中的应用

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1、RNA在病原微生物检测中的应用摘要主要分子检测技术原理及差异RNA扩增技术用于病原体检测的优势国内外病原体检测现状RNA扩增技术在临床中应用小结摘要主要分子检测技术原理及差异RNA扩增技术用于病原体检测的优势国内外病原体检测现状RNA扩增技术在临床中应用小结病原体检测方法分类以看到“整个病原体”为基础的方法镜检，培养以直接或间接看到“病原体组分－蛋白质”为基础的方法免疫学胶体金，Elisa,化学发光，etc以看到“病原体组分－核酸”为基础的方法分子生物学分子诊断概念和特点概念：利用标本中的核酸作为检测对象，对感染性疾病、肿瘤、遗传性疾病等进行诊断

2、和预后判断的方法。特点：特异性高、灵敏度高诊断范围广、适应性强什么是核酸？链状分子DNA(脱氧核糖核酸)贮存遗传信息RNA(核糖核酸)传递遗传信息遗传信息的传递途径DNARNA蛋白质转录逆转录DNAvs.RNA（一）DNA是双螺旋结构，RNA是单链结构DNA很稳定，RNA很不稳定DNAvs.RNA（二）有些RNA在细胞中拷贝数很多一个或几个拷贝DNA104核糖体RNA(rRNA)16SrRNA23SrRNA使用rRNA为靶标，可以大大提高了取样效率和检测灵敏度。常见的RNA检测技术NASBA（国外）TMA（国外）SAT（国内）SAT技术原理①②③

3、④同一温度下，首先通过M-MLV反转录酶产生靶标核酸（RNA）的一个双链DNA拷贝。然后利用T7RNA多聚酶从该DNA拷贝上产生多个（100～1000个）RNA拷贝；带有荧光标记的探针和这些RNA拷贝特异结合，产生荧光。该荧光信号可由荧光检测仪器实时捕获，直观反映扩增循环情况；同时，每一个RNA拷贝再从反转录开始进入下一个扩增循环。SAT与PCR技术原理比较RTRNAcDNART~1000copiesT7SATDNATaqTaqPCR30分钟内扩增1010倍RNADNASAT配套仪器(全自动工作站)样本---提取纯化RNA---酶反应混合液（一体

4、化）全封闭生物安全性好快（48个样本/2.5小时）摘要主要分子检测技术原理及差异RNA扩增技术用于病原体检测的优势国内外病原体检测现状RNA扩增技术在临床中应用小结DNA用于临床检验的不足“死菌检测也阳性”，与临床相关性差基因型与表型不吻合(耐药检测)不能区分“潜伏感染”“活动性感性”易交叉污染反应易受抑制SAT检测靶标为16SrRNA灵敏度更高RNA在细胞中拷贝数很多，细菌中16srRNA多达10000-20000个一个或几个拷贝DNA10416srRNAJensen,1994-16SrRNA具有高度保守性不同来源MG的16SrRNA区域，PC

5、R产物序列同源性100%，准确区别不同病原体SAT检测靶标为16SrRNA检测特异性高16SrRNA长度适中，适合做探针，检测更准确其编码基因长度约为1500bp,包含50个左右功能域RNA诊断（TMA、SAT）具有非常高的灵敏度和准确度Gen-probe:RNA检测罗氏:DNA检测与DNA相比，RNA检测更利于疗效评估及判愈DNA双链结构，较稳定，不易降解。治愈后仍有“死菌”残留，人体内完全代谢需2-3周时间<<中国性病诊疗指南>>中指出，如用PCR方法进行判愈，需在疗程结束后3-4周。RNA单链结构，易降解，病原体死亡后2-3天后完全降解与临

6、床相关性好，=“培养”，有利于疗效评估和及时判愈有些情况下，可以直接诊断“活动性感染”活动性感染：指示RNA转录活跃潜伏感染：指示RNA不转录能检测多种样本类型，比如尿液等，取样方便。数据来源：M.Chernesky,D.Jang,K.Luinstra,etal.2006.HighAnalyticalSensitivityandLowRatesofInhibitionMayContributetoDetectionofChlamydiatrachomatisinSignificantlyMoreWomenbytheAPTIMACOMBO2Assa

7、y.J.Clin.Microbiology44(2):400-405.反应不易受抑制SAT诊断技术对于病原体检测中的优势SAT产品特点SAT的优势带给临床的益处检测靶标：16SrRNA灵敏度高,特异性更强活菌检测反映临床用药的疗效结果准确度高早期诊断检出率高用药治疗后准确及时的判愈扩增产物：RNA产物易降解，减少实验室污染风险维护实验室质控水平反应不易受抑制检测样本多样化（拭子、尿液）取样方便提高了医生的工作效率减轻了病人取样带来的痛苦扩增方式：42℃恒温降低实验室设备要求缩短检测时间自动化操作更易实现报告更快速、更准确避免了人工操作带来的误差摘

8、要主要分子检测技术原理及差异RNA扩增技术用于病原体检测的优势国内外病原体检测现状RNA扩增技术在临床中应用小结国内外RNA诊断产品监管