1_Biacore_SPR原理

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1、Biacore基础课程乊一表面等离子共振(SPR)技术与Biacore原理通用电气公司生命科学部任薇薇13880720962/8008109118Weiwei.ren@ge.com课程目标•Biacore技术原理–表面等离子共振(SurfacePlasmonResonance,SPR)–传感图–Biacore提供的分子相互作用的信息•Biacore设备核心组件–SPR检测器–微流控系统(IFC)–传感芯片•Biacore分析的基本流程–固定–进样–再生BiacoreTMT200Biacore技术原理3January2012Biacore：实时、无标记、活性分子互作分析

2、结合解离Biacore实时监控分子相互结合、解离的过程表面等离子共振原理(SPR)能量入射光源反射光能量检测器角度SPR角度棱镜50nm金膜时间样品微流路液相系统表面等离子共振原理(SPR)表面等离子共振原理(SPR)•SPR是一种折光率传感器，其响应值反映了SPR角度的改变•响应信号依赖于芯片表面分子的浓度和温度•1RU的响应值大致上相当于芯片表面结合物质的浓度改变了1pg/mm2(蛋白结合与CM5芯片)传感图(TheSensorgram)稳态/平衡(Steady-state/Equilibrium)响应单位：RU解离(Dissociation)结合(Associa

3、tion)动力学，亲和力再生(Regeneration)基线(Baseline)亲和力，浓度反复上样基线(Baseline)10Biacore提供的生物分子相互作用信息：•有无结合(YesorNo)•结合的特异性和选择性(Specificity)•两种分子的结合强度--亲和力(Affinity)•结合和解离的快慢和复合体的稳定性--动力学(Kinetics)•功能复合体形成的参与者、协同者和组装顺序(Mechanism)•分子结合的温度与热力学特征(Thermodynamics)•目标分子活性含量的检测(Concentration)亲和力(Affinity,K)D弱结

4、合中等强度强结合mMµMnM10-310-610-9•亲和素-生物素结合:10−14M•强的抗原-抗体结合:10−8~10−10M•DNA与蛋白的结合:10−8~10−10M•较弱的抗原-抗体结合：10−6~10-7M•酶与底物结合：10−4~10−10M•蛋白与小分子结合：10−3~10−6M相同的亲和力，不同的动力学，不同的功能较快动力学特征的药物:低剂量即可等亲和力线达到饱和，但需要多次给药快结合/快解离较慢动力学特征的药物：需要高剂量来实现饱和，但药效持续时间久。结合速率解离速率慢结合/慢解离不同的结合与解离速率反映了不同的作用机制，也决定了分子不同的功能与结

5、构特征。Biacore应用实例基因表达调控研究RNA结合蛋白(HuD蛋白)上多个RNA识别结构域的功能动力学研究主要结合位点是RRM1RRM2与RRM3虽然对亲和力贡献不大，但却对RNA与HuD蛋白形成的复合体的稳定性有着重要的影响在获取动力学分析结果之前，结构域2、3的功能一直为研究者所忽略Biacore可研究的生物分子范围•蛋白质•DNA/RNA•脂类/脂质体/生物膜•多糖•多肽CD4/gp120naturalchemokine•小分子LMWcompoundmAb•全细胞/病毒/微生物Detergent-solubilizedGPCRsAbcapturedonse

6、nsorsurfaceBiacore™超过15000篇文献发表量Biacore应用领域包括：•肿瘤研究•神经科学•免疫科学•传染性疾病•功能蛋白质组•细胞信号传导与基因调控•疫苗开収•结合分子的筛选和表征•新药开収….….Biacore核心组件19January2012Biacore核心组件SPR光学组件IFC微流路系统传感芯片微流控系统(IFC)微流控系统(IFC)•集成化、自动化的微流路控制系统•样品消耗量低•为互作分析而设计优化IFC(放大图)流动池微流控系统(IFC)–流动池•4个流动池–位于IFC上•可选择单独、配对、串联使用。•流动池为配对使用进行了优化(

7、Fc1-Fc2,Fc3-Fc4)传感芯片葡聚糖基质羧基基团连接层CM5芯片50nm金膜玻璃层葡聚糖基质的重要性•亲水性，和2%浓度的葡聚糖水溶液环境相似•非特异性吸附极低•高结合容量•实现多种共价结合方式•出色的化学稳定性CM5传感芯片•羧基化的葡聚糖表面•最常用的传感芯片•出色的化学稳定性决定了可靠的实验重复性传感芯片的选择11种不同的芯片种类CM5,CM4,CM3：芯片蛋白、肽段、小分子等CM7：小分子化合物研究SA芯片：生物素标记的分子，如核酸、糖类等BiotinCAP芯片：可逆性生物素捕获芯片NTA芯片：His重组蛋白L1芯片：模拟脂质双分