单子叶植物CRISPR载体的构建_图文

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1、摘要1引言11•材料与方法41」实验材料41」.2体质粒载41.1.2酶和试剂41.1.2.1酶41•1•2•2•・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・・51」23生化试剂51.2仪器设备51.3实验方法51.3.1酚切51.3.2DNA片段补平61..3.3J'

2、彳匕1.3.4乙醇沉淀纯化DNA71.3.5胶回收71.3.6连接1.3.7KODplus高保真酶PCR反应1.3.8检测PCR反应81.3.9Gateway技术1.3.9.1BP反应71.3.10大肠杆菌转化1.3

3、.11质粒提取92.结果与分析122.1pWBVec8+Ga-b载体的酶切122.2载体去磷酸化122.3载体补平122.4Cas9质粒的酶切132.5含冇Cas9元件片段的补平132.6Cas9元件片段与载体的连接132.7pWBVec8+Ga-b-CRISPR质粒检测132.8入门载体的构建14153.讨论参考文献17致谢18集胞藻6803基因的克隆及植物转化载体的构建摘要：关键词：Gateway技术Keywords:Gatewaytechnology引言蓝藻是地球上最原始、最古老的一群植物，分布很广，主要生活在淡水中，海水中也有。蓝藻它是在地球上儿乎还是绝对无氧的还原环境下，第一个利用太

4、阳能将二氧化碳制造成有机物并释放出游离氧气的先驱生物，它对地球上的其他自养生物和异养生物的产生和演化，乃至人类的起源有着无可替代的重大意义。蓝藻藻休有单细胞体、群休和少数丝状体，为原核生物，细胞壁在电镜下分为四层，原生质体由屮心质和周质组成，中心质含有DNA,无核仁和核膜结构，称为原核。周质中有很多扁平膜状的光合作用片层，呈条状有规律的排列，分布在其表面的色素有叶绿素a、藻蓝蛋白、藻红蛋白及一些黄色色素。蓝藻的光合作用产物为蓝藻淀粉和蓝藻颗粒体。周质中还冇气泡。蓝藻约有150属，1500种，分布很广，从两极到赤道，从高山到海洋，到处都有它们的踪迹。根据其植物体的形态不同而分为三个纲：1、色球藻

5、纲：包括所有单细胞体和单细胞群体种类。2、藻殖段纲：包括所有不分枝或假分枝丝状体种类及丝状群体种类。3、真枝藻纲：包括所有具真分枝的丝状体种类。基因组编辑就是指定点改造基因组，得到预期的生物体基因组序列从而发生遗传改变的技术，主要是进行DNA序列的敲除、插入、定点突变和组合编辑等，从而实现基因功能与调控元件的系统研究⑴。从基因组的角度出发对植物基因进行人工改造从而培育优良品种具冇非常重要的意义。由于外源DNA与基因组靶基因发生同源重组效率很低，因此对植物基因组进行人工改造就显得异常困难。近年来，人们借用人工改造核酸酶来提高同源重组的效率，从而实现了对基因组的精确、定向的人工改造。目前应用于基I

6、大I组编辑主要包括巨核酶技术(Meganucleases)锌指核酸酶(ZFN)、以及TALEN核酸酶，它们已在植物基因工程中已经得到了成功的应用。然而传统基因组编辑技术存在明显不足，例如，ZFN和TALEN对于每一个新的ZFN或TALEN嵌合蛋白质都需要被改造才能识别靶序列，这就使两种基因组编辑系统广泛应用受阻。然而最近发现的CRISPR系统介导的基因组编辑技术只需要一小段引导RNA就能够识别特定的DNA[2]o而且一个新的位点只需耍一个新的引导RNA,极大的简化了基因组编辑的过程，扩丈了靶位点的选择。CRISPR系统也可以应用于靶向基因突变和基因修正，并口该系统也容易设计，可以实现大片段DN

7、A缺失以及用于复合基因编辑。CRISPR・Cas(clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats-CRISPR-associatedproteins)系统是细菌与古生菌中用来抵御外源病毒或质粒DNA入侵的获得性免疫系统。对于一个典型的CRISPR位点而言通常包含若干长度为20-50bp的保守性的正向重复序列和被其间隔开的短的非重复序列，以及位于重复上游的引导序列⑶。CRISPR系统存在三种类型，尤其以2型CRISPR系统研究较多，在2型CRISPR系统中存在Cas9核酸酶，乂称CRISPR/Cas9系统。Cas9核酸酶具有改造crRNA

8、和彼坏双链DNA的双重功能⑺。位于sgRNA5端的20个左右的碱基决定CRISPR/Cas9系统在应用时Cas9核酸酶特异性切割的部位，主要负责决定CRISPR/Cas9系统的特异性，因此，只要改变这段引导RNA序列即可使Cas9定位到新的DNA序列上，如果同时引用多个引导RNA也可同时进行基因组上多个不同位点的编辑，从而实现复合基因的编辑。CRISPR/Cas9系统介导的植物基因的定点突变原理为