质粒载体的构建

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1、质粒载体的构建摘要：质粒载体的构建。首先要获得目的DNA。根据其目的基因序列和启动子序列设计引物，为提高目的基因产率，采用两次PCR的方法，即第一次设计引物扩增全序列基因，第二次设计带酶切位点的引物以第一次扩增产物为模板进行扩增，进而加尾连接到T-DNA上，再利用电转化的方法将连接产物转化到带有PCAMBIA1381的DH5α感受态细胞中复制表达。关键词：质粒DNAPCR电泳感受态转化1.引言质粒（plasmid）是细菌或细胞染色质以外的，能自主复制的，与细菌或细胞共生的遗传成分。其特点如下：①是染色质外的双链共价

2、闭合环形DNA（cccDNA），可自然形成超螺旋结构，不同质粒大小在2-300kb之间，＜15kb的小质粒比较容易分离纯化，＞15kb的大质粒则不易提取。②能自主复制，是能独立复制的复制子。一般质粒DNA复制的质粒可随宿主细胞分裂而传给后代。③质粒对宿主生存并不是必需的。某些质粒携带的基因功能有利于宿主细胞的特定条件下生存，例如，细菌中许多天然的质粒带有抗药性基因，如编码合成能分解破坏四环素、氯霉素、氨芐表霉素等的酶基因，这种质粒称为抗药性质粒，又称R质粒，带有R质粒的细菌就能在相应的抗生素存在生存繁殖。所以质粒对

3、宿主不是寄生的，而是共生的。现在分子生物学使用的质粒载体都已不是原来细菌或细胞中天然存在的质粒，而是经过了许多的人工的改造。从不同的实验目的出发，人们设计了各种不同的类型的质粒载体。质粒载体pBR322是研究得最多，是使用最早且应用最广泛的大肠杆菌质粒载体之一。符号质粒载体pBR322中的“p代表质粒；“BR”代表两位两位研究者Bolivar和Rogigerus姓氏的字首，“322”是实验编号。质粒载体pBR322的大小为4361bp,相对分子质量较小的是它第一个优点。优点之二是它带有一个复制起始位点，保证了该质粒

4、只在大肠杆菌的细胞中行使复制的功能。具有两种抗生素抗性基因，可供转化子的选择标记是它的第三个优点。质粒载体pBR322的第四个优点是具有较高的拷贝数，经过氯霉素扩增以后，每个细胞中可累积1000-3000份拷贝，该特性为重组体DNA的制备提供了极大的方便。构建质粒载体所用的方法基本上是分子克隆技术，是在分子水平上提供一种纯化和扩增特定DNA片段的方法。常含有目的基因，用体外重组方法将它们插入克隆载体，形成重组克隆载体，通过转化与转导的方式，引入适合的寄主体内得到复制与扩增，然后再从筛选的寄主细胞内分离提纯所需的克隆

5、载体，可以得到插入DNA的许多拷贝，从而获得目的基因的扩增。2.材料方法2.1目的DNA的获得2.1.1引物设计第一次引物设计：正向引物：sinn3F冰盒标注：P2a引物序列：5’—AAGCAAAATCTAACCGTGTAATGTA—3’引物长度：25bp反向引物：sinn3R冰盒标注：P2b引物序列：5’—GCAAGAGCGTCGTTTGTAGTTA—3’引物长度：22bp第二次引物设计（带酶切位点）：正向引物：sinn3FE冰盒标注：P2c引物序列：5’—ACTGGATCCAAGCAAAATCTAACCGTGT

6、AATGTA—3’引物长度：34bp反向引物：sinn3RE冰盒标注：P2d引物序列：5’—TCACTGCAGCTCATAAGACCAAAGAACGTTTCTT—3’引物长度：34bp2.1.2PCR扩增2.1.2.1PCR技术的基本原理　PCR即聚合酶链式反应,是指在DNA聚合酶的催化下,以母链DNA为模板,以特定引物为延伸起点,通过变性、延伸、复性等步骤,体外复制出与母链模板DNA互补的子链DNA的过程.是一项DNA体外合成放大技术,可用于基因分离克隆,序列分析,基因表达调控,基因多态性研究等许多方面.PCR反

7、应五要素：参加PCR反应的物质主要有五种即引物、酶、dNTP、模板和Mg2PCR反应的基本步骤:1.变性:高温使双链DNA解离成单链.（94℃30s）2.退火:低温下引物与模板DNA互补区结合形成杂交分子.（55℃30s）3.延伸:中温延伸.在DNA聚合酶、dNTP、Mg2+存在下,DNA聚合酶催化以引物为起始点的DNA链5’向3’方向的延伸,合成出与模板DNA链互补的DNA子链.（70-72℃30-60s）以上三个步骤为一循环,每一循环的产物均可作为下一循环的模板,经过n次循环后,目的DNA以2n形式增加.2.1

8、.2.2PCR检测PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色琼脂糖凝胶电泳是最最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法2.1.2.3PCR反应体系第一次PCR扩增:调整PCR反应体系中各成份、组成及反应条件,经多次反复试验结果得出下