3-DNA复制修复与转座

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1、第三章DNA的复制3.1.基本概念DNA复制:亲代双链DNA分子在DNA聚合酶的作用下，分别以每单链DNA分子为模板，聚合与自身碱基可以互补配对的游离的dNTP,合成出两条与亲代DNA分子完全相同的子代DNA分子的过程。●复制子●复制体基因组DNA中的一段从复制起点到复制终点的DNA复制单元位于复制叉处的负责DNA合成的多蛋白复合体(30±)结构。DNAreplicationatphaseSofcellcycleE.coli37℃105bp/minS6-8hsM1hG23-4hsmammaliancell22-25hrs500

2、-5000bp/minG112hs?20min复制机理的复杂性D.S.DNAS.S.DNA能量的供求构型的变化超螺旋线状，开环状多种酶类的互作ReplisomeDNA复制起始控制机理知之甚少复制的准确性（修复，校正）研究试材的特殊性（温度敏感型ts，突变抑制体系Su）DNA复制速度(E.coli105bp/min，高速解旋112km/h?)缺乏统一的模式(D.S.DNA,S.S.DNA,LinearDNA….)3.2.复制起点和方向复制起点的特点oriC“呼吸现象”DNA复制原点处氢键迅速断裂与再生,导致两条DNA链不断解链与

3、聚合,形成瞬间的单泡状结构的过程。在富含AT的区域内尤为明显replicationorigin两侧基因的转导频率高复制模式多样245bpminimaloriginofreplicationrichAT&DNApolymerase(DnaA)bindingsite单起点、单方向多起点、单方向单起点、双方向多起点、双方向OriCOriCRichATRichATDNA复制方向BidirectionalreplicationMonodirectionalreplication双向等速复制子链DNA延伸方向DNApolymerasere

4、actsonthe3’endonlyOHTCATCACOH3’NewDNAelongationfrom5’to3’directionpppOHC++ppi5’PPP5’PPP如果DNA的延伸方向是3’→5’ATCG+5’pppOH3’GpppOHGATCG5’pppOH3’ATCG+5’pppOH3’GpppOHG5’ppp因能量的需要,DNA的5’端必须带有PPP游离dNTP具有PPPpppOH3’ATCG在0.2MNacl的生理环境中，磷酸基团间的强电负性，使dNTP难以聚合到DNA的5‘端，而且双链DNA的5’端碱基配对

5、困难需要其他机制以解脱碱基发生错配后的校正……费时、费能、增加脱磷酸、加磷酸的能量消耗ATCGpppOH+pppApOHTCGpppOHTCGTCGpppOH3.3.DNA半保留复制3‘5‘3‘5‘OK!How?5‘3‘5‘3‘a)OkazakifragmentE.coli[t-]2’’,7’’,15’’,60’’pulse-labelingindT-H3stopinKCN0℃D.S.DNAS.S.DNADensitygradientofsucroseMeasureH3-Tpulse-chase20℃indT-H330’’tr

6、ansfertodTthencontinueH3-Tpulse-chasepulse-labeling120’’60’’15’’7’’2’’10S(1kb)40S(Prok.400Nt/sec)DNAreplicationinOkazakifragment1kbpulse-chase120’’AtleastonestrandofDNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘DNAreplicationinOkazakifragment1kb5‘3‘5‘3‘（semi-discontinuo

7、usreplication!）？？？？？？？？？？半不连续复制evidencedUMPfragmentinDNAdUTP:dTTP=1：300incell---A-------T--------G--------C----AUGUdutgenedUTPase少数dUTPDNA中不能有U?---A-------T----突变频率=1/1200！？---A------A------U---------UngaseungU尿嘧啶-N-糖苷酶UUdenaturedumpfragment~1200base~Okazakifragment

8、●ung–dumpfragmentlonger●dut–dumpfragmentshorterAAleadingstrand,laggingstrand均有dUMP的掺入Okazaki片段在某种意义上为dUMP片段先导链按dUMP片段连续复制后随链按Okazaki片段不连续复