杨璐-化学发光磁酶免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体(西北大学硕士学位毕业PPT

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1、化学发光磁酶免疫分析法检测梅毒螺旋体抗体答辩人：杨璐导师：崔亚丽教授李如琳副教授西北大学Contents1.背景介绍3.全文总结2.实验部分梅毒●梅毒螺旋体●严重性传播疾病●发病率不断上升2010年4月国家卫生部全国法定传染病疫情报告：全国乙类法定传染病发病第３位梅毒检测：●孕前检查●供血者血液常规筛选检查西北大学医院常用梅毒螺旋体免疫学检测方法快速血浆反应素环状卡片实验试验（RPR）和甲苯胺红试验(TRUST)初筛假阳性高判断主观梅毒螺旋体血球凝集试验（TPHA）和梅毒螺旋体明胶凝集试验（TPPA）确认判断主观操作繁琐要求严格梅毒ELISA实验灵敏度有待进一步提高西北大学化学发

2、光免疫分析技术免疫分析系统化学发光分析系统（抗原、抗体，免疫反应）★免疫分析高特异性及化学发光高灵敏度于一体（酶的化学发光底物或氧化剂）西北大学梅毒螺旋体抗体化学发光法检测灵敏度极高自动化聚乙烯酶标板●板表面包被面积有限●反应空间有限●灵敏度受限化学发光固相载体的选择磁性微粒●比表面积大●分散性好●易分离●灵敏度更高西北大学金磁微粒化学发光检测方法GoldMag-AS微米金磁微粒1.生物分子固定化容量大2.超顺磁性，易分离西北大学包被反应检测实验原理西北大学第一部分方法的优化1HRP标记抗原稀释液的确定2包被抗原最佳用量及酶标抗原最佳工作浓度的确定3样本稀释液的确定4保护剂的选择

3、西北大学HRP标记抗原稀释液的确定aPBST+20%小牛血清bPBST+0.1%BSAcPBST+0.5%BSAdPBST+1%BSAePBST+1.5%BSA降低非特异性吸附：加入非特异性蛋白与表面活性剂阴性样本的发光值西北大学包被抗原和酶标抗原最佳工作浓度的确定抗原包被量(ng/孔)酶标抗原稀释度701402102803501:2000PN660271652562954603945677336671:3000PN21742744571735502494644947601:4000PN13746543501538501816563171541:5000PN14042478501

4、18142554342943341:6000PN12142319386574249434201927最佳抗原包被量：210ng/孔；最佳酶标抗原工作浓度：1：3000西北大学样本稀释液的确定阳性血清稀释倍数检测结果1×PBS生理盐水PBS+0.1%BSA正常人血清1:25++++1:50++++1:100++++1:200++++1:400++++1:800++++1:1600++++1:3200++++1:6400+-+-++1:12800--++1:25600--+-+-1:51200----最佳样本稀释液：PBS+0.1%BSA检测灵敏度与正常人血清相当西北大学保护剂的选择

5、保护剂X对HRP标记抗原的保护作用良好HRP标记抗原置于37℃、放置6天西北大学保护剂X对包被抗原金磁微粒的保护作用包被抗原金磁微粒置于37℃、放置6天稳定性很好西北大学保护剂Proclin300与保护剂X的对比实验选定浓度为0.05%的Proclin300作为保护剂西北大学保护剂Proclin300对HRP标记抗原的保护作用含0.05%Proclin300的HRP标记抗原置于37℃、放置6天西北大学第一部分实验小结在初步建立的化学发光检测梅毒螺旋体抗体方法的基础上进一步优化，确定各最佳工作条件如下：1.HRP标记抗原稀释液：PBST+1%BSA作为HRP标记抗原稀释液；2.抗原

6、包被量：210ng/孔(7µg/mg)；3.酶标抗原稀释浓度：1:3000时，发光强度达到最佳；4.血清样本稀释液：PBS+0.1%BSA；5.保护剂：浓度为0.05%Proclin300的PBS缓冲液。西北大学4参考值6对比实验1稳定性3标准曲线25精密度特异性第二部分实验方法的评价西北大学稳定性化学发光试剂分别置于4℃冰箱和37℃生化培养箱中放置6天将阳性血清分别稀释50倍、100倍、200倍、400倍后进行检测西北大学精密度国家标准（≤15%）批内差：2.86%～5%次数检测结果阳性检测平均值RSD（%）1PN54231557352362491560571557471559

7、4923586052PN59982359232363941561251558762359721560483.103PN60741562491563022365151561561560221562192.864PN62871561662367432365341559832360122362884.775PN59232357991564011561372361171560932360783.38西北大学批间差：5.1%～9.7%西北大学次数检测结果批次1批次2批次3阳性检测平均值RS