基于藏象属性与干细胞分化的表观遗传学特性研究“中药归经”

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1、成都中医药大学硕士学位论文（基础医学院）二0一七届硕士研究生学位论文基于藏象属性与干细胞分化的表观遗传学特性研究“中药归经”StudyonthemeridiantropismtheoryofChineseherbalmedicinebasedonpropertiesofzangxiangandepigeneticcharacteristicsofstemcelldifferentiation研究生姓名：淮文英指导教师：张天娥学科专业：中西医结合基础二○一七年五月万方数据成都中医药大学硕士学位论文学位论文基于藏象属性与干细胞分

2、化的表观遗传学特性研究“中药归经”淮文英指导教师姓名：张天娥申请学位级别：硕士专业名称：中西医结合基础论文提交时间：2017年5月论文答辩时间：2017年5月21日二○一七年五月万方数据成都中医药大学硕士学位论文摘要目的：利用酶高效性和专一性特点，探讨甲基化酶与乙酰化酶系列，分析其相关表观遗传学特性。从全新的角度探索和验证中药归经理论的实质，初步探索中药归经评价体系客观化标准。方法：1、各组含药血清的采集与制备随机取SPF级雄性6-8w的SD大鼠9只，将制备好的归肝经的蒺藜、归肾经的蛇床子、归肝肾经的川续断三味中药的水煎剂，

3、连续7天灌胃给大鼠，每天2次，每次灌胃后观察大鼠活动状态有无异常。灌胃第7日，即末次灌胃后在一定时间内（末次灌胃前12小时禁食不禁水）股动脉取血。再将装有股动脉血的真空采血管置于4℃冰箱2h，3000rpm/min离心15min，吸出上清液移入离心管，再放入56℃水浴锅30min以灭活补体，防止细胞毒，用0.22μm针式滤器过滤，制备好后密封放入零下80℃冰箱备用。2、骨髓间充质干细胞的分离培养及鉴定本实验选用全骨髓培养法，取SD大鼠，颈椎脱臼法处死，75%乙醇浸泡3-5分钟。用碘伏棉球消毒皮肤，无菌条件下取出双侧完整的股骨

4、和肱骨，置于培养皿中小心剔除粘连于骨上的肌肉组织，剪断骨端，用抽取适量培养基的注射器插入骨内反复冲洗骨髓腔，直至骨发白，冲洗液直接收集在离心管中，离心5min（1500rpm/min），弃上清，加入新鲜的完全培养基(含10%FBS,1/100ml双抗溶液)，接种于培养皿中，置于37℃、5%CO2恒温培养箱中培养过夜。24h首次半量换液，3d全量换液，以后每2-3d换液1次，待细胞生长至约80%融合时，用0.25%胰蛋白酶溶液消化，按1:1比例常规传代。通过不断的更新培养基来进行纯化，进行形态学观察、绘制生长曲线，采用流式细胞

5、仪对CD90、CD34、CD45表面抗原进行鉴定。3、各组归经含药血清对骨髓间充质干细胞的作用第3代BMSCs做细胞悬液，用血小球计数板进行细胞计数，调整细胞密度为1×610/ml，每孔500μl接种于24孔板。将细胞分为四大组：空白组、蒺藜组、蛇床子组和川续断组。药物组分为24h和72h两大组，每个药物组细胞再分为20%和10%两个高、低血清浓度组，空白组用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基正常培养。各组细胞置于37℃、5%CO2恒温培养箱中分别培养24h和72h。4、不同归经药物对BMSCs的表观修饰相关基因表达影

6、响第1页万方数据成都中医药大学硕士学位论文采用q-RT-PCR法分别检测Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a、Hdac1对用药BMSCs作用24h和72h的mRNA表达量的影响。5、不同归经药物对脏器组织的表观修饰相关基因表达影响采用q-RT-PCR法分别检测Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a、Hdac1对肝脏、肾脏和脾脏的mRNA表达量的影响。结果：1、灌胃期间，三组大鼠精神充沛，活动灵便，饮食正常，皮毛整洁，体重增长良好，大便正常，各组大鼠均未出现死亡。2、刚分离的原代细胞悬浮于培养液中，大

7、小不一，多数呈圆形或椭圆形，24h后可见部分细胞已经贴壁，呈纺锤形、多角形等多种形态，3d后细胞形成散在集落，细胞突起变长，长短不一，粗细不均。传代后的细胞生长速度明显加快，贴壁所用时间短，至2代后，细胞呈梭形，似成纤维样细胞，形态均一，呈漩涡状有序排列，可见少许悬浮细胞，换液后悬浮细胞消失。通过流式细胞仪鉴定第三代培养细胞，结果显示其细胞表面标志物CD90呈阳性表达，阳性表达率为94%；CD34和CD45均呈阴性表达，表达率分别为14.2%和1.1%。其结果说明了本实验室所用全骨髓培养法培养、纯化的BMSCs达到了要求。3

8、、接种于24孔板的BMSCs，通过采用上述细胞用药的方法，观察细胞形态，发现用药24h后细胞形态依旧呈梭型，似成纤维细胞样，见少许悬浮细胞。用药72h后，细胞培养基稍许浑浊，见较多悬浮细胞。4、药物作用BMSCs24h后，川续断高浓度组的Dnmt3a、Camkmt、Kdm1a、Kat2a和