20170814 质粒构建流程

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1、20170814质粒构建流程武汉大学Angelo一、引物设计1）取得目的基因序列，可选用数据库NCBI2）软件分析目的基因可用酶切位点。使用primer5分析出序列不包含的酶切位点，即为可用酶切位点。3）选择载体。根据转染细胞和实验室资源，选择合适载体。如pMSCV，4）选择酶切位点。对照目的基因可用酶切位点和载体上的酶切位点，选择二者共有的作为备选。载体上两个酶切位点的距离应有几十bp以上，选实验室常用酶切位点。5）使用primer5设计目的基因引物，目的产物应包含从启动子到终止子前的全部碱基。6）根据选择的酶切位点，查找对应的酶切位点保

2、护碱基，将对应片段添加到设计的引物两端，注意酶切位点的前后顺序。一般选择三个保护碱基。7）引物设计完成，送公司合成。二、目的片段获取方法一：1.RNA提取2.RNA反转录获得目的片段方法二：从韩家淮实验室索取（通常采用）具体流程：1、PCR扩增PCR程序：95℃5min95℃30s58℃30s72℃延伸（根据基因片段大小设定时间）35cycle72℃5min22℃保存注：可根据不同基因调节退火温度，延伸时间，循环数。2、PCR产物纯化1）根据PCR基因的大小配制1%-2%琼脂糖凝胶，放电泳槽里，点样并电泳10-20min2）割胶回收（产物电

3、泳结果含杂带）①将含目的条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5mlEP管。②加等体积（1g=1ml）GCbuffer,65℃水浴10min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min，进行试剂盒回收③溶液加入回收柱中，12000rpm离心，1min，废液倒回再离一次④弃废液，加500μlwashingbuffer，离心12000rpm，1min⑤弃废液，加500μlPWwashingbuffer，离心12000rpm，1min⑥空管离心12000g，2min，弃废液，柱子转移到新1.5mlEP管⑦加入30-50μlelutionbuf

4、fer于硅胶膜上，室温孵育2min，离心13000g，1min标上基因名称，日期⑧电泳检测三、载体和片段双酶切（分开酶切）20μl反应体系如下片段：PCR纯化产物16μlFDbuffer(10×)2μl酶A1μl酶B1μl反应条件：37℃水浴2h加loadingbuffer（10×）终止反应注：buffer类别依使用的酶具体选择载体：载体质粒大于1.5ug并补ddH2O至16ulFDbuffer(10×)2μl酶A1μl酶B1μl反应条件：37℃水浴2h或以上加loadingbuffer（10×）终止反应注：buffer类别依使用的酶具体选

5、择四、载体酶切产物回收和纯化片段一般不进行胶回收，只进行回收柱纯化1）一般配制1%琼脂糖凝胶，放电泳槽里，点样并电泳20-30min（琼脂糖凝胶配制：琼脂糖凝胶（1%）30ml琼脂糖粉0.3g1×TAE30ml微波炉加热溶解，冷却一会儿后加入1μlgoldview核酸染料或溴化乙锭（有毒），混匀，倒板，插梭子。）2）割胶回收（产物电泳结果含从载体上切下来的杂带）①将含载体条带的琼脂糖凝胶切下（切得尽量小），放入1.5mlEP管。②加等体积（1g=1ml）GCbuffer,65℃水浴10min左右至胶溶解（溶液为淡黄色），混匀2min，进行试

6、剂盒回收③溶液加入回收柱中，12000rpm离心，1min，废液倒回再离一次④弃废液，加500μlwashingbuffer，离心12000rpm，1min⑤弃废液，加500μlPWwashingbuffer，离心12000rpm，1min⑥空管离心12000g，2min，弃废液，柱子转移到新1.5mlEP管⑦加入30-50μlelutionbuffer于硅胶膜上，室温孵育2min，离心13000g，1min标上载体名称，酶切位点名称，日期（片段同此相同）⑧电泳检测五、连接一般15μl（20μl）连接体系：片段：载体=4:1=12.5ul（

7、也要考虑到载体回收浓度）10×T4buffer1.5μlT4ligase1μlPCR仪中进行：22℃，1h（根据所连接上的片段大小进行选择连接时间）4℃冰箱过夜保存或当天进行转化注：连接产物-20℃可长期保存六、转化准备：碎冰，灭菌EP管、LB空液体培养基，带抗性培养板，超净工作台，移液枪，水浴锅加热42℃1）将感受态细胞置于冰上，待其融化2）超净工作台中，将连接产物10μl加入100μl感受态细胞，或质粒1-3μl加入100μl感受态细胞3）轻混匀，冰浴30min4）热击水浴42℃，90s，冰浴1min5）加900μlLB空培养基，摇菌8

8、0rpm，37℃，1h-2h6）浓缩离心2500-3500rpm，2min，去清液留约200μl重悬管底菌体，涂板7）完全吸收后，37℃倒置培养12-16h七、菌落PCR挑选阳性