菌株鉴定方法研究进展【文献综述】

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毕业设计文献综述生物科学菌株鉴定方法研究进展[摘要]：本文主要综述了目前菌种鉴定中主要使用的常用鉴定方法，分析其各自原理及一些影响因素，并阐述各自的优缺点，并根据各自的应用范围和条件，选择合适的鉴定的方法。对于不同的菌株，采取的鉴定方法也会有很大的不同。[关键字]：菌株鉴定；鉴定方法；优缺点从菌株的分离到菌株的筛选再到鉴定，整个过程下来才能确定一株未知菌。而整个过程中的鉴定对确定菌株就显得极其重要了。细菌鉴定是指将分离培养获得的病原菌，通过纯化培养使其达到不含有其他微生物的纯培养程度，继而进行系统鉴定。菌种保藏机构在收集一些已经冻干的菌种时，应在开启后经过两代的适应性培养方可进行复核性的系统鉴定。系统鉴定是通过细菌的形态结构、生长特性、抗原性、病原性以及目前流行的核酸测定方法等检测，并用已知标准免疫血清确定分离细菌的属、种和型(群)[1]。确定菌种不仅可以了解未知菌的特性，还可以丰富菌种库，为微生物这一领域做出贡献。而对于确定菌株仅仅依靠一种鉴定方法是远远不够的，必须结合几种方法才能准确的确定出未知菌的种。目前采用的菌株鉴定方法主要有：传统方法，仪器自动化鉴定,分子生物学方法。考虑到这三种方法的优缺点，现在大多数是将这三种方法结合起来进行菌株的鉴定，增加准确性。当然，三种方法比较起来，分子生物学的方法是最为准确的。下面将这三种方法进行进一步的介绍分析。1传统方法传统方法就是直接对菌株的菌落特点进行观察和利用显微镜对菌株形态进行进一步的观察，同时对菌株进行一定的生理生化实验，来大致的确定菌株的属。1.1形态结构形态结构观察主要是用各种对应方式的染色方法如革兰氏染色、芽孢染色等对被染色的微生物形状、大小、排列方式、细胞结构及染色特性在显微镜下直接观察，以及微生物在平板上生长的菌落形态特点等因素，从而达到区别、鉴定微生物的目的[2]。同时细菌培养时要注意培养基的挑选，一些细菌的特殊结构如荚膜、鞭毛、菌毛、芽孢等[3]，它们要在特定的培养基上才能表达正常生长发育。在镜检时观察细菌基本形态结构和大小及其排列状态、菌落的形状、有无形成芽孢等。因此据此可以对不同微生物加以区别鉴定。1.2生理生化实验微生物生理生化反应是用化学反应来测定微生物的代谢产物，生理生化反应常用来鉴别一些在形态和其它方面不易区别的微生物。因此微生物生理生-4- 化反应是微生物分类鉴定中的重要依据之一。形态学鉴定辅加生化试验在细菌鉴定中具有重要的意义,生理生化试验是根据细菌培养过程中不同菌种所产生的新陈代谢产物各有不同,同样表现出不同的生长特性。通过生物化学的方法来检测这些物质的存在与否,从而能够得到细菌的鉴定结果。如糖(醇)类代谢试验、v-p试验、吲哚试验、MR试验、硝酸盐还原等[4]。但是因为生理生化实验的局限性，用此法鉴定菌种，往往只能鉴定到属，不能明确到种，如GONZLEZCJ等[5]从淡水鱼及其生境中分离了249株益生菌并对其进行了形态学和生理生化特征进行了鉴定，其中92％以上的菌株被鉴定到属的水平[5]。WIJTZEST等利用2种碳源发酵测试体系也未能将14种益生菌分离株鉴定到种的水平[6]。对于一些益生菌而言表型形状的鉴定是很有用的，可以非常明确地鉴定其为那个种属的细菌，但是也有一些益生菌，虽然其表型性状非常相似，但是这并不意味着他们基因型具有很近的亲缘关系[7]。综上所述，传统的细菌学检验与鉴定需要进行细菌培养及一系列生化反应或免疫学检测，环境样品中的细菌检测与鉴定还需要前增菌培养、选择性培养及生化鉴定等程序，既费时又费力，对有些细菌尚不能给出理想的鉴定结果[8]。虽然其存在一些不足但它在鉴定过程中是不可或缺的，必需得进行。2仪器自动化鉴定随着仪器分析技术的进步和计算机的广泛应用,微生物菌种鉴定逐渐由传统的形态学观察和人工生理生化实验鉴定发展进入了基于仪器自动化分析的鉴定系统阶段。近20年来，不断推出并取得了一些效果，如VITEK系统、MDI系统、BIOLOG系统、SENSITITRE系统、AUTOSCEPTOR系统以及MICROSCAN系统等[9]。下面以BIOLOG微生物鉴定系统为例，简述微生物自动鉴定系统的工作原理：Biolog微生物自动分析系统是美国Biolog公司从1989年开始推出的一套微生物鉴定系统，发展到现在已经能鉴定包括细菌、酵母、丝状真菌在内的近2000种微生物，其中酵母菌有52个属、267个种。与其他鉴定系统相比，Biolog微生物自动鉴定系统能利用计算机进行数据分析，自动化和标准化程度高，大大简化了鉴定程序，具有数据库广、鉴定范围大、快速鉴定等优点[10-11]。细菌在利用碳源时，会将四哇类氧化还原染色剂(TV)还原成紫色，从而在鉴定微平板上形成该菌株特征性的反应模式或“指纹图谱”，通过纤维光学读取设备读数仪来读取颜色变化，由计算机通过概率最大模拟法将该反应模式或“指纹图谱”与数据库相比较，可以在瞬间得到鉴定结果，确定所分析的菌株的属名或种名[12]。较传统的鉴定的方法，仪器自动化鉴定减少操作的时间，更加提高实验的效率，但其仪器较昂贵。3分子鉴定法-4- 分子鉴定是通过对菌株的遗传信息进行检测，来确定菌株。常用的有以下几种测定技术。3.1GC含量的测定每一种生物的DNA均有特定的（G+C）mol%，不同生物的（G+C）mol%各不相同。若生物间亲缘关系较远，则（G+C）mol%差别较小，反之亦然。因此对于（G+C）mol%的差异大小就应有个相应的标准来确定其亲缘关系，一般来说，同一种微生物，其种内各菌株间的（G+C）mol%值可相差2.5%～4.0%，差值过小(低于2%)，则没有分类学上的意义；若差值在5%以上，可认为是2个不同的种；若相差超过10%，则可考虑它们属于不同的属[13-14]。由于每一种微生物的（G+C）mol%通常是恒定的，不受菌龄、生长条件等各种外界因素的影响，故（G+C）mol%测定在微生物分类鉴定中有着较大的应用价值。但（G+C）mol%值的用途主要在于排除不确切的分类单元，而不是用它去建立一个新的分类单元。3.2DNA－DNA分子杂交技术核酸探针就是一段能与靶核苷酸互补的单链核酸，大多是DNA。由于碱基反应的高度专一性，即使靶DNA只存在很少的互补序列，探针也能与之结合，进行杂交反应。因此核酸探针非常适合于各种各样的鉴定。DNA探针鉴定方法具有快速、灵敏、特异性高等特点，它可以从天然环境或混合菌中检查出目的菌，而不需要看到他们或分离纯培养。使用特异的探针，可以鉴定特定的株系、特定的种和属、不同的分类等级乃至所有的生物。核酸探针也可以从混合的生物材料探测目的生物。尤其对一些难于培养或还不能培养的微生物，也可以用核酸探针了解它们的存在。虽然核酸探针不能辨认死菌和活菌，已经死了的菌或细胞只要其DNA尚存，就可以检测到它的存在。但通过DNA探针进行Southern分析，所需探针特异性很强，一般只适于特异性菌种或一个菌种中的不同菌株,而且仍不能解决属以上分类单位间的正确关系及细菌的进化问题[15]。EfiaMalinen等[16]利用DNA探针来鉴定L．helveticus的野生型及突变型并获得了成功。此法常用来分析菌株之间的亲缘关系，同时也是细菌鉴定的一个重要指标。3.3扩增片段长度多态性(AFLP)分析此种方法又称是DNA指纹技术，种测定基因组限制性片段的DNA指纹技术,通过PCR选择性地扩增整个基因组DNA的内切酶片段,在分辨率高的聚丙烯酰氨凝胶上电泳,产生一组特异的DNA限制性片段的指纹图谱。与其他DNA指纹技术相比有其独特的优点:可用于各种大小不同的基因组的指纹分析,为研究细菌属乃至株间的亲缘关系提供一个有效手段;具有一定的灵活性,可通过特异性PCR引物的设计和内切酶组合的选择,调整AFLP图谱中限制性片段的适宜数目;由于适用了严格的PCR条件和高分辨率的聚丙烯酰氨凝胶电泳,因而重复性好,分辨率高;AFLP不仅仅是简单的指纹技术,而且可作为连接遗传图谱与物理图谱间的桥梁而用于基因组的研究。-4- 3.4recA基因序列分析recA基因负责编码recA蛋白质，后者在DNA重组、DNA修复与SOS应急反应中具有至关重要的作用[17]。发育亲缘研究的分子标记Kullen[18]等首先将这种方法引入双歧杆菌属的研究，这种分子可以通过PCR技术从双歧杆菌典型菌株的肠道分析物中直接获得引物是针对recA基因内特定区域的寡核苷酸。该区域在细菌内具有通用保守性在该方法中形成的片段长度约为300kb这种recA基因有望成为一种对人体肠道双歧杆菌分离物进行比较性进化发育研究的有力工具[19]。3.5根据16s或23SrRNA序列的DNA在生物进化过程中rRNA的功能几乎保持不变的，且分子中某些部位的排列顺序变化非常缓慢，因而得以保留古老祖先的一些序列。16S或23SrRna序列的DNA标记技术利用PCR的方法，采用针对16SrRNA基因两端通用保守区的引物直接对所分离到的菌株进行16SrRNA基因扩增，然后测定整个PCR复制子的序列组成，并与rRNA数据库进行比较[20]。从分析分子技术的几种常用的方法，我们可以看出分子鉴定的明显的优点在于它比较准确的检测出菌株的遗传信息，即准确的鉴定出未知菌的种属。但该方法要求实验室必须具备较齐全的实验设备。利用分子方法鉴定出奶牛乳房炎病原菌细菌素产生菌[21]，可以为乳制品市场做出重大的贡献。4总结如果只是利用传统方法只进行形态鉴定和生理生化实验则实验耗时就比较长同时也只能初步的鉴定菌株。而分子鉴定法则弥补了传统方法的不足，它能准确、快速的鉴定出菌株。而随着科学的不断进步，分子鉴定法呈现出广阔的应用前景。同时仪器自动化鉴定也为菌株鉴定打开快速准确的鉴定之门。参考文献[1]杜昕波,赵耘,李伟杰.菌种保藏中的细菌鉴定方法[J].中国兽药杂志,2009,43(3):50-52.[2]赵永．益生菌的分离及其益生特性的研究［D］．扬州：扬州大学，2007．[3]陆承平.兽医微生物学[M].第3版.北京:中国农业出版社,2005:17-19.[4]管志远,王艾琳,李坚.医学微生物学实验技术[M].第1版.北京:化学工业出版社,2006:31-46.[5]GONZLEZCJ，ENCINASJP，GARCIA－LOPEZML，etal．Character－izationandidentificationoflacticacidbacteriafromfreshwaterfishes［J］．FoodMicrobiology，2000，17（4）：383－391．[6]WIJTZEST，BRUGGEMANMR，NOUTMJR，etal．Acomputerisedsystemfortheidentificationoflacticacidbacteria［J］.FoodMicrobiology,1997,38(1):65－70．[7]段宇珩,谈重芳,王雁萍,等.益生菌鉴定方法在食品工业中的应用及研究进展［J］.食品工业科技，2007，28（2）：242－244．[8]邵虎.不同分类鉴定方法在益生菌菌株研究中的应用[J].农业科技与装备,2010,(193)7:27-30.[9]刘大波,李文献,王少武,等.益生菌与益生菌乳制品的研究现状及发展趋势［J］.-4- 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