专家视角李金明我国临床分子诊断试剂发展问题及思考

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1、［专家视角］李金明：我国临床分了诊断试剂发展:问题及思考•、历史我国的临床分了诊断试剂的出现，最早可以冋溯到上世纪80年代，较国外晚10年左右，当时国外主要用于遗传病的诊断,我国则主要用于乙型肝炎等传染病的检测，这与我国人群乙型肝炎病毒(hepatitisBvirus,HBV)的感染率高，乙型肝炎患者较多是分不开的。那吋，主耍是釆用硝酸纤维素膜上斑点杂交方法，探针采用32P标记，杂交完成后，通过放射自显影显示结果，后來，逐步发展到采用牛物索或地高辛等非同位索标记。上世纪90年代以前，在我国涉及乙型肝炎治疗的医院临床实验室应用核酸斑点杂交检测HBV

2、DNA相当普遍。斑点杂交技术的特点是简单方便，但检测敏感性低，今天看来，将其用于对检测灵敏度要求较高的病原体的检测并不合适。1983年，美国Cetus公司的Mullis发明了PCR技术,其利用DNA高温变性和低温复性的棊木原理，通过变性、复性和延伸3个温度变化，成功实现了DNA在体外的复制。但该技术最初市于每一扩增循坏均需加入DNA聚合酶(因其不I耐热)，实际应用受到限制，成为PCR应川于疾病诊断的瓶颈，随后儿年,该公司成功从美国黄石国家公园温泉中分离到的嗜热菌中得到了耐热的DNA聚介酶(TaqDNA聚合酶),1989年被美国Science杂志命

3、名第一个“年度分了”使PCR临床应用的瓶颈问题迎刃而解，从而使得PCR成为临床分子诊断和生命科学研究中的一个革命性技术，预示着分子时代的到來。因此到90年代初期，国内一批研究人员迅即将这一技术用于HBV的临床检测，岀现一人批牛产PCR试剂的公司，采用的基本技术是PCR-琼脂糖凝胶电泳方法，靶核酸经PCR扩增后，会出现一定长度片段的特异扩增产物，电泳分离示，经溟化乙咙染色，紫外线下可见相应的分子大小的条带。到90年代中期，又冇一些厂家,生产了PCR-板上朵交即PCR■酶联免疫吸附试验(ELISA)方法。但由于PCR■琼脂糖凝胶电泳利PCR-ELIS

4、A均为PCR后有一个开管取扩增产物进行分析的过程，极容易出现扩增产物被“污染”所致的假阳性结果，临床反映强烈，直接导至1998年4月卫生部下文暂停了PCR检验在临床中的应用。其实在90年代屮期，国内一些企业已意识到这种假阳性带来的问题，开始研发实时荧光PCR检测试剂，并用于临床检测。二、现状及问题临床检验的发展方向无疑是自动化，临床分了诊断亦是如此。自动化带来了“检测系统”的概念，即检测仪器、试剂和校准品的一体化，从而避免了同一•试剂在不同实验室配不同仪器所带來的结果不确定的问题，但山于我国整体工业水平(尤其是原材料工业和精密加工工业)与西方发达

5、国家的差距，在国产仪器设备的基础实现临床检验的自动化尚需时临床分子诊断尤甚。因此，目前我国的临床分子诊断在核酸提取、扩增反应液准备、扩增前加样、上机、产物分析和结果分析报告等方面仍是以手工操作为主。分子诊断中繁杂且要求精细的手工操作步骤,使得临床实验室工作人员总在不断追求操作步骤简单的试剂，试剂生产厂家为满足用户的这种需求，也在努力追求操作简单化，于是一些只需要简单核酸提取或不需核酸提取、最少试剂配制的检测试剂应时而生。如目前在国内广泛使用的HBVDNA实时荧光PCR试剂。任何一件产品，如果生产过程只是追求简单,则一定会以质量下降为代价。因此，国

6、内的用丁传染病检测的PCR试剂如HBVDNA、内型肝炎病毒RNA(HCVRNA)和人类免疫缺陷病毒-1RNA(HIV-1RNA)定量检测，与国外同类试剂盒和比较,一直存在重复性、分析敏感性和抗干扰(溶血、黄疸、脂血等)能力差等问题［1,2,3］o存在这些问题的最根木原因主要在于核酸提取，荧光PCR扩增阶段的试剂水平与国外并无太大差业。临床标木屮可能存在血红蛋白、乳铁蛋白、免疫球蛋白G（lgG）、胆红素、血脂等均是PCR扩增反应的抑制剂,是否能有效地将这些抑制物从标本中去除，决定了后续的PCR扩增效率。核酸提取方法过于简单，则无法将这些抑制物有效去

7、除，直接影响后而的扩增检测结果，影响上述检测性能。而且，也因为这些抑制物的存在，无法在扩增检测时加人样本加入量。样木加入量小，一是加样的重复性和准确性都相对较差，最后会反映在整个检测的重复性差;二是直接影响分析敏感性。作为PCR扩增来说，从理论上讲，每个反应管内至少有1个分子，才会出现扩增，加样量少，在标本内和应靶核酸含量少的情况下,则収得1个以上靶分子的可能性也小,反之越大。相对于传染性病原体核酸检测來说，人的基因检测试剂在上述方面问题相对较少,因为人的基因含量高,一般不存在因标木屮基因组含量少而彫响检测敏感性的问题，通常的核酸提取方法均可达到

8、相应要求。近年來，随着谿物基因组学和肿瘤靶向治疗等的研究进展，与个体化治疗川约相关的基因多态性、基因突变和基因量的变化等的检测正迅速走向