第16章免疫诊断技术

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1、第16章免疫诊断技术第16章免疫诊断技术第16章免疫诊断技术血清学试验试剂血清补体抗原单克隆抗体基木结合实验放射性免疫测定抗体放射性免疫测定抗原放射性免疫测定免疫荧光试验直接免疫抗体试验间接免疫抗体试验颗粒凝集性荧光免疫测定流式细胞术免疫酶测定微孔EIJSA试验Western-blotting免疫组织化学一次性免疫分析器材免疫过滤免疫色谱抗体标记二次结介试验沉淀反应Precipitation免疫扩散免疫电泳及其相关原理抗体滴左凝集试验抗体球蛋白被动凝集病毒性红血球凝集及抑制试验补体固定细胞毒性试验活性系统测

2、定中和实验保护性实验免疫学实验的诊断应用诊断实验室中，动物的免疫反应冇两种形式的应用，笫一，用特异性抗体检测或证实一种抗原的存在。这种抗原是连在感染性物质上的或仅简单•地是一个待定位或待检测的分子。笫二种形式是通过检测血清中特异性抗体的存在來判断动物是否在先前已受到特足生物侵犯，这有助于建立诊断方法或判断动物感染特定生物的程度。因诊断目的而进行的抗原一抗体间作用的方法叫血清学。血清学技术分为三个大的类别，基础实验是直接评估抗原与抗体的结合（表16-1）:二次实验是评估机体抗体间和互作用结呆，这些实验比基础实

3、验的灵敏度低，但比基础实验操作更简便或需要更简单-的技术；最复杂的实验是活体实验，评估动物体中抗体的实际保护效果。血淸学实验试剂血淸：实验屮最普通的抗体来源是血淸，是通过血液凝固收缩析出的液体。血淸要冰冻保存，在需要时再进行实验。如果需要，血淸可在56°C放置30分钟，以消除补体活性。补体：补体是新鲜血清中的普遍成分，但在新稣，未经加热的儿内亚猪血清中，补体是溶血实验中最有效的成分。作为血清学用途的补体来源的血清应小量冰冻保存。一旦解冻，就要立即使用，不可反复冰冻融化。抗体球蛋门：因为免疫球蛋门是复杂的蛋门

4、质，因此将它们注射入不同种属的动物体内，它们是具有抗原性的。例如纯化的犬免疫球蛋门注射入猪体内，猪就会产生反应形成特异的抗体，称为抗体球蛋白。根据注射用的免疫球蛋白的纯度，形成针对所有种类的免疫球蛋白的非特升性抗体球蛋口，非常特升的抗体球蛋口对仅针对单一种类。抗体球蛋口在许多免疫学实验中是必需的试剂。单克隆抗体：来源于杂交瘤的单克隆抗体是纯化的和特异的，可作为标准的化学试剂，并口其数量是无限的（第11章）。单克隆抗体在免疫诊断实验中经常会取代传统的抗血清。基木结合实验基木结合实验是将抗原抗体结合后，计算形成

5、的复合物数量。放射性同位素，荧光染料，胶体金和1第16章免疫诊断技术酶均可用來标记，确认一种反应物。放射性免疫测定利用放射性同位索作为标记的测定有高度灵敏性，但由于放射性存在危险，此方法价格昂贵，因此在需要高度灵敏情况下，才使用放射性材料进行放射性免疫测定。抗体放射性免疫测定放射变应性吸附法（radioallergosorbenttest,RAST）用于测量过敏动物特异性IgE水平，此方法是将浸冇抗原的纤维素板完全浸入实验血清中，使一些抗体结合到抗原上，冲洗去未结合抗体后，将板浸入含有放射性标记的抗抗体的溶

6、液中。如果抗体已经结合到抗原上，抗抗体才能结介到纤维素板上。结合到板上的放射活性量是血清中抗体活性水平的一个衡量标准。抗原放射性免疫测定竟争性免疫测定的原理是未标记抗原取代免疫复合物的标记抗原（图16-1）,这种方法极其灵敏，因此多用于微量药品的检测。抗原（或药品）用一种同位索如氟（H3）,C14或1125标记，当放射性标记的抗原与其特异的抗体混合时，它们会结介形成免疫复介物并且从溶液屮沉淀岀來。上清液屮放射能力是未标记抗原数量的衡量标准。如果未标记抗原加入到混合物汇总，它会与标记抗原竞争结合抗体结合位点，

7、结果一些标记抗原就不能结介，这样上清夜的放射活力量增加。如果预先建立一条已知未标记抗原数量的标准I1U线，那么试验样品的抗原数量就可参考此曲线以衡量。免疫荧光测定初级结合实验中常川荧光染料來标记，其中最重要的是荧光界硫鼠酸脂（fluoresceinisothiocyanate,FITC）。FITC是一种黄色复合物,它能结合到抗体上而不影响其活性。当290um和145um不可见紫外光或蓝光照射，FITC在525um会发出可见的绿光。F1TC标记的抗体用于直接或间接荧光抗体实验。直接荧光抗体实验此法用于抗原的检

8、测，针对于特异的抗原如细菌或病毒的抗体首先用FITC标记。含有生物体的组织或涂片固定在一玻璃片上，后用一种标记性抗血清孵育，冲洗掉未结合抗体（图16-2）°当生物体在显微鏡暗视野的紫外光源照射，与标记抗体结合的生物体会发出明亮的荧光，这种实验也可用于数量很少的细菌的检测。例如，可用來检测疑患副结核分支杆菌动物的粪便或检查损伤涂片，损伤由坏死梭杆菌（Fusobacteriumnecrophorum）,单-核细胞增生