高效液相色谱法简介

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1、高效液相色谱法简介主讲：郑萍高级工程师，执业药师化学化工学院1液相色谱分析是在经典的液体柱色谱基础上，引入了气相色谱的理论；在技术上采用了高压泵、高效固定相和高灵敏度检测器，实现了分析速度快、分离效率高和操作自动化，这种柱色谱技术被称做高效液相色谱法。高效液相色谱分析概述2慢中等快色谱分离Temporalcourse淋洗液3叶绿素的柱色谱4三组分混合物的分离5在C18柱中，三组分混合物流出色谱柱的顺序为：萘，联二苯、蒽。当试样混合物进入色谱柱后，就在固定相和流动相之间不断地进行分配平衡。不同的化合物，分子结构不同，存在理化性质的差异，所以在两相中存在的浓度也各不相同。固定相中存

2、在量多的化合物，冲洗出柱子的时间就长，反之则短。这与分配系数有关：K=化合物在固定相中的浓度C固化合物在流动相中的浓度C流K值小，先流出柱子，K值大的，保留作用强，后流出柱子。67键合相-反相色谱8§1.概述色谱法：(chromatography)：以试样组分在固定相和流动相间的溶解、吸附、分配、离子交换或其他亲和作用的差异为依据而建立起来的各种分离分析方法称色谱法。几个概念色谱柱：进行色谱分离用的细长管。固定相：管内保持固定、起分离作用的填充物。流动相：流经固定相的空隙或表面的冲洗剂。9§1-4高效液相色谱法的特点一高压液相色谱以液体作为流动相（称为载液），液体流经色谱柱时，

3、受到的阻力较大，为了能迅速地通过色谱柱，必须对载液施加高压。在现代液体色谱中供液压力和进样压力都很高，一般可达到150～300kg／cm2，甚至可达700k／cm2以上。10二高速高效液相色谱所需的分析时间较之经典液体色谱快得多，一般可达l—10mL／min，个别可高达100mL／min以上，这已近似于气相色谱的流速。三高效气相色谱的分离效能很高，高效液相色谱的柱效则更高，一般约可达60000理论塔板／米；11四高灵敏度紫外检测器的最小检测量可达毫微克数量级(10-9g)；荧光检测器的灵敏度可达10-11g。高效液相色谱的高灵敏度还表现在所需试样很少；微升数量级的样品就足以进行

4、全分析。12§1-5高效液相色谱流程和设备高效液相色谱仪一般可分为5个主要部分：高压输液系统，进样系统，分离系统和检测系统。此外还配有辅助装置：如梯度淋洗，自动进样及数据处理等。其工作过程如下：首先高压泵将贮液器中流动相溶剂经过进样器送入色谱柱，然后从控制器的出口流出。当注入欲分离的样品时，流经进样器贮液器的流动相将样品同时带入色谱柱进行分离，然后依先后顺序进入检测器，记录仪将检测器送出的信号记录下来，由此得到液相色谱图。1314样品吸收度测定—吸收池示图15紫外检测器工作原理1617开始分析废液样品淋洗液至分离柱进样阀样品装样废液淋洗液至分离柱定量环进样（ＬＯＡＤ）（ＩＮＪＥ

5、ＣＴ）样品环18液相色谱动画演示19二、色谱图（chromatogram）试样中各组分经色谱柱分离后，按先后次序经过检测器时，检测器就将流动相中各组分浓度变化转变为相应的电信号，由记录仪所记录下的信号——时间曲线或信号——流动相体积曲线，称为色谱流出曲线，或色谱图。如图12-2常用术语：1.基线:在操作条件下，仅有纯流动相进入检测器时的流出曲线。202.色谱峰:当组分随流动相进入检测器时，其响应信号大小随时间变化所形成的峰形曲线。正常的色谱峰呈正态分布。3.峰高与峰面积峰高：色谱峰顶点与峰底之间的垂直距离称为峰高(peakheight)。用h表示。峰面积：峰与峰底之间的面积称为

6、峰面积(peakarea)，用A表示。21§2－1保留值一、保留时间（tR）从进样开始到柱后出现样品的浓度极大值所需的时间为保留时间，用tR表示。22§2-2色谱柱的分离效率及柱效能的评价一、塔板理论塔板理论认为，一根柱子可以分为n段，在每段内组分在两相间很快达到平衡，把每一段称为一块理论塔板。设柱长为L，理论塔板高度为H，则H=L/n式中n为理论塔板数。23色谱柱的分离效率（简称柱效），可定量地用理论塔板数N来表示。理论塔板数一N还与柱长有关，当比较两不同长度的色谱柱的柱效时，应当比较它们在相同柱长下的V值。理论塔板数N24可用半峰高处的峰宽(半峰宽）和保留时间的关系来表示理

7、论塔板数N，这时关系式为：N＝5．54(tR/Wt1/2)2﹙2﹚式中：Wt1/2-------------半峰宽例如，从图2-3，测得tR=105mm、Wt1/2=4mm，求得N=3789，若此柱长为250mm,折成每米的理论塔板数约为15200.25§2-3分离度及影响因素一分离度（分辨率)研究色谱中有关分离问题时，首先就是要能定量地确定相邻两峰的分离程度。从图8-3可以看出，为了获得较好的分离，就必须使最大峰值之间的距离增加，峰宽减小。2627一般用Rs来定量表达相邻两峰的分离程度，所