自噬和蛋白酶体蛋白降解途径在糖尿病肾病中的变化研究

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1、编码Uqcrfsl的cDNAo将PCR产物克隆至pUM-T载体，经限制性内切酶消化及测序，证实为UqcrfslcDNA序列后，将Uqcrfs1/pUM-T重组子亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1/V5-HiSo经限制性内切酶鉴定及测序正确后，采用磷酸钙共沉淀法瞬时转染HEK293T细胞，同时转染载体pcDNA3.1/V5-His及绿色荧光蛋白，分别作为对照以及观察转染效率的参照。转染36h后收集细胞，分别提取总RNA及蛋白。使用RT-PCR.WesternBlot方法检测Uqcrfs1/pcDNA3.1A/5-His重组质粒在转录及蛋白水平的表达。结果：琼脂糖凝胶电泳显示

2、RT-PCR扩增片段大小符合大鼠UqcrfslcDNA大小；PCR产物克隆至pUM・T载体后，经酶切及测序结果证实PCR扩增得到编码Uqcrfsl的cDNA序列正确；将Uqcrfs1/pUM-T重组子亚克隆至真核表达载体pcDNA3.1A/5-His,酶切鉴定得到片段大小与质粒图谱一致，测序结果证实为UqcrfslcDNA序列；磷酸钙共沉淀法转染HEK293T细胞后，RT-PCR方法检测到UqcrfslmRNA的表达，WesternBlot方法检测到融合蛋白的表达，pcDNA3.1/V5-His空载体转染组、HEK293T细胞组均未在转录与蛋白表达水平检测目的基因产物，结果

3、达到预期。结论：本研究成功构建了大鼠gcrf沁基因的軍:组质粒，该重组质粒可在HEK293T中过衣达，该工作为为研究大鼠Uqcrfsl«因在糖尿病及其并发症发病机制的分子牛炊学论用及药物靶向治疗提供了实验基础PU-325自噬和蛋白酶体蛋白降解途径在糖尿病肾病中的变化研究张浩军1李治国1,2董晞1王红盼1,3路晓光1李平1*1中日友好医院2河北联合大学3北京中医药大学100029【摘要】目的：糖尿病肾病(DiabeticNephropathy,DN)是糖尿病(DiabetesMellitus.DM)最严重的微血管并发症之一。近年来研究发现DN发生时肾组织中存在着损伤蛋白质积聚

4、,蛋白酶体途径和自噬途径是细胞内损伤蛋白质清除的两条主要途径，其降解底物有所交叉,而且有相互代偿作用。本研究以高糖培养的肾小球系膜细胞和自发性2型DN模型OLETF大鼠为研究对象，探讨蛋白酶体途径和自噬途径在DN的变化情况。方法：原代分离培养肾小球系膜细胞，高糖环境下(30mM简萄糖)孵育Oh、8h、16h.72h,MTT法检测细胞增殖情况。收集细胞提取蛋白，Westernblot检测蛋白酶体途径蛋白酶体a各亚基(PsmAs)和自噬途径标志物LC3蛋白的表达。从日本引进自发性2型DN模型OLETF大鼠，以遗传背景相似而不发生糖尿病的LETO大鼠为正常对照，观察28周，实验期

5、间每4周动态监测体重、血糖及24h尿蛋白定量，实验结束时处死大鼠，取肾组织，观察病理形态学并进行半定最评分；利用Westernblot法分析肾皮质中PsmAs和LC3蛋白的表达。结果：高糖培养后显著抑制了系膜细胞的增殖。高糖环境F8h蛋白酶体a各亚基、LC3I和LC3II蛋口表达均降低，且有统计学意义。其它各时间点变化无统计学意义。OLETF大鼠与正常对照LETO大鼠比较，血糖水平和24h尿蛋白定量逐渐升高，具有统计学差异（P<0.01）oOLETF大鼠肾小球硬化指数和肾小管间质纤维化指数均显著為于LETO大鼠，具有统计学盘义（P<0.01）；OLETF大佩36周龄肾皮质中

6、PsmAs蛋白表达明显减少，与正常对照LETO大鼠比较，有统计学意义，LC3II蛋白表达也有降低趋势，但无统计学意义。结论：DN时自噬途径和蛋口酶体途径均明显下调，可能导致损伤蛋白在肾组织的积聚，介导了DN的发生发展。PU-326慢性肾功能衰竭微炎症'伏态、HSP70.AQP2与中医证型关系研究李小会陕西中医学院附属医院肾病科712046【摘要】目的:观察慢性肾功能衰竭（chronicrenalfailure,CRF）微炎症状态、热休克蛋白70（HSP70）、水通道蛋白2CAQP2）的表达及其与屮医证型的关系，探讨CRF正虚、水湿、浊毒内盛的可能证候机制。方法：选择CRF2

7、、3期患者60例，其中2期42例、3期18例。按《中药新药临床研究指导原则》辨证标准，采取积分定证世法，60例CRF患者辨证分为脾肾阳虚证组26例，气阴两虚证组19例，湿热证组15例。另设健康对照组（对照组）15例。检测患者外周血单个核细胞（PBMC）NF-kB活性、血清HSP70、IL・6、尿AQP2含址，分析其与中医证型的相关性。结果:①CRF想者PBMCNF-kB活性为0.67±0.33,血清IL-6含鱼、尿AQP2含5:分别为35.1317.19pg/ml,96.65±18.28pg/ml；对照组NF-kB