黑木耳栽培技

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1、综合性（设计性）实验实验报告实验名称：微生物纯种分离与活菌计数法姓名：陈双翠指导教师：毛宁专业：生物科学实验班级：10级（2）班实验时间：2013年5月〜6月实验地点:微生物实验室成绩：一、实验口的1了解从土壤屮分离和纯化微生物的基本原理2掌握常用的微生物分离和纯化的方法（涂布平板法、平板划线分离法、稀释倒平板法）3学习通过平板菌落进行活菌计数的原理与方法二、实验原理自然条件下的微生物往往是不同种类微生物的混合体。为了研究某种微生物的特性或者要大量培养和使用某种微生物，必须从这些混杂的微生物群落中获得纯培养，这种获得

2、纯培养的方法称为微生物的分离与纯化。土壤是微生物生活的良好环境，其中生活的微生物数量和种类都是极其丰富的。土壤中的微生物数量与种类非常多。以土壤为样品，应用梯度稀释法、涂布平板法、平板划线分离法、稀释倒平板法分离各种微生物，根据不同的材料，可以采用不同方法，菌落计数后，通过菌落形态观察并挑取菌落进行划线分离纯化,多次重复后得到单菌落。必要时再对单菌落进一步分离纯化。在用稀释平板法分离微生物时，还可以同时测定待分离的微生物的数量。三、实验仪器与试剂1高压蒸汽灭菌锅、恒温电热干燥箱、生化培养箱2器材：酒精灯电炉接种环无菌

3、试管三角瓶记号笔天平火柴无菌培养血无菌移液管玻璃涂棒试管架无菌生理盐水盛无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶等四、实验步骤与方法1采样;取表层以下5-10cm的土样放入灭菌的袋屮备用。或者放入4°C的冰箱暂存。2倒平板（无菌操作）：培养基加热熔化，待冷却至55-60°C,在电炉中将三角瓶内的培养基熔化，取灭菌的培养皿，每组倒12个平板。3土壤稀释液的制备（梯度稀释法）1）先准备好一系列含有培养液的试管：9ml、99ml的试管若干个。2）取lml原菌液，加入99ml试管中，吹打混匀后，吸出lml加入9ml中，吹打混匀后析出lm

4、l加入9ml依次加入制成一系列稀释菌液。具体做法如下：称取lg土样,无菌操作倒入99mL无菌生理盐水中，在震荡器中振荡20分钟，使微生物细胞分散，静置20〜30s,即成IO?稀释液；再用5L移液器，吸取稀释IO?液lmL,移入装有9mL无菌水的试管中，振荡，让菌液混合均匀，即成2稀释液；再换一支无菌吸头，吸取103稀释液1讥，移入装有9讥无菌水的试管中，振荡，即成IO。稀释液；以此类推，连续稀释，制成IO?、103、1（/、IO：等一系列稀释菌液。4平板涂布、（涂布平板法）涂布平板法是一种将菌体按比例制备成若干个稀释

5、度，再分别经涂棒涂布培养而进行微生物分离纯化的方法。（1）倒平板；（2）制备土壤稀释溶液连续不，断稀释，得到不同稀释度的土壤溶液;（3）涂布分别吸取三种稀释度菌液，均匀涂于培养基表面；具体步骤：将培养基平板编号，然后用移液枪吸取103、104、10,等一系列稀释菌液各0.JmL对号接种在不同稀释度编号的琼脂平板上（每个编号设两个重复）。再用无菌涂布棒将菌液在平板上涂布均匀，每个稀释度用一个灭菌涂布棒；更换稀释度时需将涂布棒灼烧灭菌。5培养将涂布好的平板平放于桌上20〜30min,使菌液渗透入培养基内，然后将平板倒转。

6、恒温37°C培养，两天后观察.6平板划线分离法平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表点击此处添加图片说明面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都曲单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的。用灭菌接种环蘸取IO?稀释液一环于已凝固的平板上进行划线。划线可按以下两种方式进行：一种为交叉划线法，是在

7、平板的一边做第一次“Z”字形划线。转动培养皿约70°角，将接种环在火上烧过并冷却后，通过第二次划线部分，做第二次'字形划线。同法进行第三次、第四次划线。另一种为连续划线法，是从平板边缘的一点开始.连续作紧密的波浪式划线，直至平板屮央。转动培养1111180°,再从平板另一边（不烧接种环）同样划线至平板中央。7培养将平板倒转，恒温37°C培养两天后观察菌落计数1）直接计数法（肉眼计数）含菌样品的微生物经稀释分离培养后，每一个活菌细胞可在平板上繁殖形成一个肉眼可见的菌落，故可以根据平板上菌落的数口推算出每克含菌样晶屮所含

8、的活菌总数（菌落形成数目）每克含菌样品中微生物的活细胞数（菌落形成数，CFU二同一稀释度平板上菌落平均数X10X稀释倍数）/含菌样品克数2）血细胞计数法将稀释的菌液样品滴在血细胞计数板上，在显微镜下计算4-5个中格的细菌数，并求出每个小格所含细菌的平均数，再以此为依据，估算总菌数。五、实验记录1）直接计数法（肉眼计数）不同浓度的活菌落数H数梯1