Why is it difficult to Derive Pluripotent Stem Cell in Domestic Ungulates？

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1、WhyisitsoDifficulttoDerivePluripotentStemCellinDomesticUngulates？ContentIntroduction机体器官通过小细胞群包括器官特异性的细胞或成体干细胞来抵消器官在生理学上的消耗。根据其发育潜能分为单能干细胞和多能干细胞，单能干细胞只能分化形成一种特定的细胞类型，多能干细胞能形成三胚层的任意细胞。当干细胞开始进行定型时，三胚层的细胞被定义为多能性。但多能性局限于上胚层，所以稳定的多能性细胞只存在于体外而非体内(Smith2001)。。。。。。TrueEmbryonicStemCells目前只从小鼠[]，人[

2、]和非人灵长类动物[]胚胎中分离获得了真正意义上的胚胎干细胞(ESC)。所有这些物种建立的细胞系具有共同的特性：能够在体外进行自我更新，能够分化形成组成机体的所有组织类型，表达OCT4、SOX2、NANOG等多能性因子，将其注入免疫缺陷的小鼠中能够形成畸胎瘤。而灵长类物种ESC与小鼠的ESC相比具有明显的不同。首先是培养基的不同，小鼠ESC依赖于LIF和BMP4，通过激活JAK/STAT3信号通路来维持细胞的增殖并不分化[]，而此通路的激活反而会促进灵长类ESC的分化[]。灵长类ESC多能性的维持需要细胞因子FGF2和激动蛋白A，依赖于Nodal信号通路的激活[]。小鼠ES

3、C只能从特定的允许型鼠系分离获得，而人和灵长类动物具有特异的基因背景，在ESC的分离上没有局限性。小鼠和灵长类动物ESC在形态上存在差异性。小鼠ESC形成的克隆集落细胞排列紧密，呈凸起状，而灵长类ESC的克隆集落较大，呈扁平状。mESC分离成单细胞后能够继续增殖，但对灵长类ESC来说将会致死，灵长类的ESC克隆集落需要机械地剥离饲养层，不能消化成单细胞。一般而言，mESC其生命力旺盛，易于适应培养环境。而灵长类ESC生长比较缓慢，对培养环境比较敏感[]。mESC最显著的特征是能够形成嵌合体，当ESC处于较好的细胞状态时，能够产生生殖系嵌合体。也有很多人尝试非人类灵长类ESC

4、的嵌合体制备但均以失败而告终。近来已被证实罗尾猴ESC不能整合入整个囊胚，但首次获得了四细胞胚胎的嵌合体[]。这表明灵长类ESC是由于不能形成单细胞而不是因为其可塑性较低。事实上，小鼠ESC以单细胞悬液的形式注入囊胚产生嵌合体。相反，灵长类动物ICM不能以单细胞悬液的形式存活，同样对于其ESC也是不可能的。因此，不论在体内ICM中还是体外ESC中，灵长类多能性干细胞对特异细胞粘附信号的依赖导致不能形成嵌合体。我们总结了不同物种ESC的不同特性(如表1)，但究其原因一直没有大量的研究对此作出解释，直到Brons等，Tesar等人从植入前小鼠胚胎(E5.5-E7.5)上胚层分离

5、获得了多能干细胞，这相对于标准的植入前小鼠胚胎(E3.5或更早)是一项突破，获得的细胞系称为上胚层干细胞(EpiSC)。EpiSC细胞系的培养依赖于激动蛋白A和FGF2细胞因子，其克隆集落的形态也与之前获得的细胞系不同，并且对于单细胞消化具有敏感性，不能形成嵌合体，这些特征区别于人类和非人类灵长类ESC的特性，与小鼠ESC也不同。EpiSC依赖于细胞粘附信号，不能以单细胞形式存活，不能形成嵌合体。以上这些为啮齿类和灵长类ESC的差异性提供了生物学解释。现在清晰的是两类细胞是从胚胎发育的不同时期分离的：一类被称为原始型(naive)，存在于植入前小鼠胚胎囊胚；一类被称为受训型

6、(primed)，存在于灵长类植入前囊胚和小鼠植入后胚胎[]。目前大家公认的是灵长类ESC更接近于小鼠EpiSC而不是小鼠ESC的干细胞状态。Howcanweexplainthefactthatmousepre-implantationblastocystsgiverisetoESCbutprimatepre-implantationblastocystsgiverisetoEpiSC?(为什么小鼠植入前囊胚能够产生ESC而灵长类植入前囊胚产生EpiSC?)目前存在一假说，从胚胎分离的细胞在体外培养时会发生进一步的分化。事实上，虽然Brook和Gardner证实mESC来源

7、于上胚层细胞，小鼠胚胎2.5天时没有形成上胚层[]，在第3.5和4.5天胚胎时期已经形成上胚层，但是从2.5天小鼠胚胎分离获得的ESC与从3.5天和4.5天胚胎分离获得的ESC相比不存在明显的差别[]。这些表明细胞在体外缺乏体内胚胎环境的条件下可能会自发进入上胚层阶段。有研究证实将mESC培养在含生长因子FGF2和激动蛋白A的培养基中能够分离出EpiSC，表明EpiSC是ESC在生理学上的进化结果[]。事实上，在缺乏LIF和FGF2条件下，将3.5天小鼠胚胎的ICM培养2周，期间对其进行轻微的细胞解离，最终能够分离