基于微流控芯片的肺癌间质表型高转移亚系的筛选及EMT相关miRNA的鉴定与功能验证

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1、分类号：R329.2单位代码：10159密级：公开学号：201010014博士学位论文中文题目：基于微流控芯片的肺癌间质表型高转移亚系的筛选及EMT相关miRNA的鉴定与功能验证英文题目：EstablishmentofmesenchymalsublinewithhighlymetastaticpotentialbasedonmicrofluidicsystemandevaluationofEMT-relatedmicroRNAs论文作者：于敏指导教师：方瑾教授学科专业：细胞生物学完成时间：2018

2、年10月中国医科大学博士学位论文基于微流控芯片的肺癌间质表型高转移亚系的筛选及EMT相关miRNA的鉴定与功能验证EstablishmentofmesenchymalsublinewithhighlymetastaticpotentialbasedonmicrofluidicsystemandevaluationofEMT-relatedmicroRNAs论文作者于敏指导教师方瑾教授申请学位理学博士培养单位生命科学学院一级学科生物学二级学科细胞生物学研究方向肿瘤细胞生物学论文起止时间2010年8月

3、—2018年1月论文完成时间2018年10月中国医科大学（辽宁）2018年10月中国医科大学博士学位论文摘要目的：肿瘤是当前世界范围内严重威胁人类健康的重大疾病，转移是引起临床肿瘤患者死亡的主要原因。在肿瘤转移的过程中，上皮间质转化（EMT）起到了非常重要的作用，肿瘤细胞可通过EMT获得间质表型，表现为具有更强的迁移、侵袭、转移能力，从而更具恶性，更易于发生转移。因此建立EMT研究模型对于探索肿瘤转移机制、筛选特异性好的肿瘤转移相关标志物具有重要意义。筛选获得的肿瘤转移及EMT相关标志物可用于临床

4、肿瘤转移的早期判断和有效治疗。目前，研究EMT的主要策略可以分为两类：一类是通过施加特定的影响因素诱导肿瘤细胞发生EMT，包括给予TGF-β、转染EMT转录因子等；另一类是从异质性肿瘤细胞中筛选获得具有间质表型的高转移性亚系细胞，其筛选依据是基于异质性肿瘤组织和细胞系中存在的具有不同上皮和间质表型的亚群细胞，通过对比核酸、蛋白表达等方面的差异，获得EMT相关分子，作为判断肿瘤转移的重要依据，因此通过筛选亚系有助于发现新的EMT及转移相关标志物。具有间质表型的高转移细胞亚系可通过体内筛选法获得：向免

5、疫缺陷小鼠体内注射肿瘤细胞，具有更强基质降解能力的细胞可形成转移灶，通过对转移灶肿瘤细胞进行扩大培养来获得具有间质表型的高转移力细胞亚系，该方法能较好地重现体内复杂的肿瘤转移环境，但是受到宿主差异的影响较大，而且费用较高、耗时较长。因此，体外筛选法日渐成为另一种重要的筛选策略，其典型代表为基于肿瘤生物学功能进行筛选的Transwell小室筛选法：通过稀释的基质胶模拟体内基底膜微环境，在物质浓度梯度驱动下收集获得具有更高侵袭能力、更强基质水解能力的间质表型亚系细胞，该法操作相对简便，易于标准化，在筛

6、选新的标志物方面具有良好的可比性，但需要较多的筛选轮次。因此，建立更加高效、简便的肿瘤间质型高转移亚系的筛选方法具有很大的必要性。微流控芯片是近年来兴起的可将生物、化学等反应集成到一块微米尺度芯片中自动完成的新型微全分析系统，具有制备简便、易于集成、模拟性强、流体操控性强等优势，已广泛用于细胞分选、培养、侵袭、趋化、血管生成等研究中。本研究利用单泵控制浓度梯度形成的微流控芯片系统，提供持续稳定的浓度梯度及侵袭驱动力；通过浓度逐渐增加的基质胶提高筛选压力和筛选效率，利用间质I中国医科大学博士学位论文

7、表型细胞的强基质降解能力和侵袭能力对其进行有效富集，建立高效获得具有间质表型的高转移亚系的芯片筛选系统，为进一步筛选肿瘤转移和EMT相关标志物提供新的思路和可行性。microRNA（miRNA）是一类存在于真核细胞内的非编码RNA，其成熟体由18~25个核苷酸组成，通过与靶基因的3’UTR相结合而在转录后水平来抑制靶基因的表达，参与调节细胞增殖、分化、迁移、侵袭、转移等多种生物学过程。目前已知多种miRNA与肿瘤EMT和转移密切相关，但miRNA的表达及作用机制非常复杂：同一个miRNA可同时调控

8、多个靶基因，而同一个基因也受到多个miRNA的调节，因此对转移和EMT相关miRNA的筛选和作用机制研究具有重要意义。肺癌现已成为发病率和死亡率最高的恶性肿瘤，本研究拟通过建立的微流控芯片亚系筛选系统，对异质性肺癌A549细胞进行间质表型高转移亚系的高效筛选和鉴定，利用母系和亚系在侵袭、转移能力等方面的差异，进行miRNA表达谱分析，以期获得新的转移及EMT相关miRNA，并为肺癌转移及其调控机制的研究提供新的方案。研究方法：1.微流控芯片的制备和亚系筛选芯片系统的建立。①芯片制备