冷冻切片操作指南

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1、超薄切片机操作指南超薄切片为透射电子显微镜观察提供超薄高分子和生物材料样品的专门技术。针对高分子和生物材料，由于电子束穿透能力的限制，必须把样品切成厚度小于100nm，即采用超薄切片机进行切片。一、切片类型材料的超薄切片分为两大类，一类是常温超薄切片：主要应用于一般的高分子材料；另一类是冷冻超薄切片（Cro-Ultramicrotomy）：主要应用于软材料如软塑胶和橡胶等，在低于其玻璃转变温度时进行切片（温度越低、块越硬）。二、切片原理采用机械推进式。即刀固定，样品每上下运动一次时向前推进一小段距离，进行切片。特点：在设定的切削行程区间，样品以可控速度切片。三

2、、衡量超薄切片的质量3.1样品结构保存良好；3.2切片厚度为70nm左右；3.3切片均匀，无污染，表面无褶皱，无刀痕、无震颤及染色沉淀等现象；3.4样品支持膜耐受电子束轰击，观察时无膜的漂移和破裂现象。四、常温切片的一般操作流程：1、包埋2、修样3、制刀槽4、装样品5、装刀6、注水7、定位8、设定参数，切片9、捞取样品10、复位11、关机4.1包埋包埋的目的：用包埋剂支持整个样品结构，并形成特定的机械性能,以便于切片。4.1.1一般选用Spurr树脂环氧树脂进行包埋标准硬度的配方（试剂可以按比例增减）性能标准坚固硬偏硬性软快速聚合慢速聚合成分/gERL-422

3、110.010.010.010.010.010.0DER-7366.04.05.07.06.06.0NSA26.026.026.026.026.026.0第1页共6页DMAE0.40.40.40.41.00.2聚合时间8888316*ERL-4221：二氧化乙烯基环，分子小，粘度低，聚合块硬度大。*DER－736：聚丙二醇二缩水甘油醚，增韧剂，分子小，有低粘度性质，可调节包埋块硬度。*NSA：壬烯基琥珀酸酐，一种特殊硬化剂，应避免暴露在潮湿的大气中，以防环氧或酐链的水解作用。*DMAE：二甲基氨基乙醇(DMAE)，固化加速剂，使树脂混合物的使用期限延长。调整D

4、MAE的量，可调整固化时间。·Spurr树脂最终硬度可用DER－736量调节；调整固化时间，可调整DMAE的量。4.1.2包埋方法：前三种试剂依次称量，均匀混合后加入加速剂DMAE，再搅拌均匀，保证没有气泡。包入样品，放入烘箱，一般固化7-8h，烘烤温度为75度。4.1.3注意事项：（1）所有试剂要防潮；（2）配包埋剂时，每加入一种试剂要搅拌均匀；（3）包埋时动作要轻巧，防止产生气泡。4.2修样包埋完成后的样品块须先经过修整，降样品块尖端修整长适当大小及形状，并将要观察的部分露出。习惯上将样品块修成金字塔形（从侧面观察），顶面修成梯形或长方形，每边长度大小应小

5、于0.5mm（一般0.2~0.3mm），金字塔高度不宜超过0.2mm。将样品块修成平顶的金字塔型，是为了让样品在切片过程中得到最佳的支持力。高度过大，切片时容易发生震动，在切片上留下深浅交替的平行条纹，或导致样品块前端断裂。较小的样品块较容易进行切片，但过小的切片在电子显微镜下可观察到的东西较少。修样步骤：4.2.1固定样品：把烘好的环氧树脂取出，固定在修样台上；4.2.2修样（1）削去表面的包埋剂，露出样品；（2）用双面刀片在样品的四周削去包埋剂，将样品块修成金字塔形（从侧面观察），顶面修成梯形或长方形顶部保证有样品。第2页共6页修样详细步骤示意图：4.2.

6、3注意事项：（1）修样品是最关键的一步，修样过程中不要破坏样品；（2）保证修好的顶部有样品；保证顶部足够小。（3）样品顶部不管修成哪种形状，其顶边和底边必须平行，否则不能形成连续切片带4.3制刀槽4.3.1制刀切片一般用玻璃刀，也可用钻石刀。钻石刀可以切较硬的样品，但其价格昂贵。一般选用玻璃刀，玻璃刀由5～7mm厚的硬质玻璃制成，用专门的制刀机（用RMC公司的GlassKnifeMaker）制刀。适宜的刀刃应该是平整光滑，无锯齿状波纹。整把刀最适合切片的部分为Z区，约占1/3；S区不用于切片；而E区的使用需视刀口的品质而定。4.3.2制刀槽超薄切片只有漂浮在水

7、面上或其他合适的液面上才便于收集、伸展和捞取，为此在刀口背部装上一个小的水容器，通常称为“刀槽”。刀槽可用塑料水槽围成，刀与塑料水槽接触处要用熔化的石蜡封固接口，以防漏水。4.3.3注意事项（1）三角形刀只有一边可做刀口。（2）酒精清洗刀槽，不能有污染物；（3）保证水面稍低于刀口，让样品沿着这个斜面一片连着一片往下走4.4装样品第3页共6页把已修好的样品夹入样品架内，把样品架装在样品臂上。4.5装刀把刀槽装在刀座上，固定。把上刀架放到下刀架上，移动上刀架，在刀口离样品1mm时，固定下刀架。并根据样品软硬程度不同调节玻璃刀的倾斜角度，一般为4°。刀座介绍注意事项

8、：装刀的时候要小心不要让刀口碰到样品。