《水产生物遗传育种学》学生实验

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1、1.材料与方法1.1实验材料实验用鱼：由河北农业大学海洋学院第二生物试验室提供，鱼已达到性成熟，体质量为705go实验药晶：鲤•鱼卡诺固定液、Giemsa染液、苏木精染液、低渗液（0.075mol/lKC1溶液）、磷酸缓冲溶液（PH=6.8）、PHA（75%植物血凝素）、秋水仙素（0.3%）、生理盐水、肝素钠（500单位/ml）。1・2实验药品液体配制1.2.1卡诺固定液的配制：冰醋酸溶液与甲醇溶液以体积比1:3的比例混合，根据实际用量现配现用。1.2.2Giemsa染液的配制：称取Giemsa粉末0.5g加儿滴廿油充分研磨后再加33ml甘油,56°C恒

2、温水浴1.5~2h,再加33ml甲醇搅拌均匀后,过滤。1.2.3磷酸缓冲溶液（PH=7.8）的配制：称取Na2HP04•12也0结晶2.3876g用蒸锚水配制成100ml溶液,另称取KH2PO4固体粉末0.9078g用蒸憎水配制成100ml溶液,取已配置好的Na2HP04溶液49.0ml与KH2P04溶液51.0ml混合均匀，配制成100mlPH=7.8的磷酸缓冲溶液。1.2.4生理盐水的配制:分别称取NaCl、KCl、CaC12固体粉末7.5g、0・35g、0.21g并分别用蒸懈水溶解，Z后均匀混合定容至1000mlo1.2.5苏木精染液的配制：称取苏

3、木精晶体2.0g,溶于少量酒精小，加入冰醋酸100ml后搅拌,充分溶解后加入100ml甘油和95%酒精100ml。称取KA1S0,5.0g,充分研磨后溶T100ml蒸憎水并加温，将加温后的钾矶溶液一滴滴加入染色剂屮，并不断搅动，全部溶液加入后，瓶口用双层纱布包扎，放于通风处并经常摇动，直到颜色变为紫红。1.3实验方法1.3.1前处理采用林义浩植物血细胞凝集素（PIIA）体内注射法稍作修改⑵，向试验鱼胸腔内注射PHA（注射部位胸鳍基部），剂量为5ug/g,注射后给以充足的氧气暂养24h,再向试验鱼胸腔内注射秋水仙索，剂量为2.5ug/g,注射秋水仙索后暂养

4、4ho1.3.2取材抽血后的试验鱼剪腮放血，取鱼头疔于生理盐水屮清洗2~3遍，除去血块及其他组织，然后置丁•盛有少量生理盐水的培养皿中，用小剪刀充分剪碎，然后用200目的筛绢网过滤分两组置入离心管中，用吸管吹打5min,静置片刻，制成细胞悬液。1.3.3低渗处理将1.3.2处理的细胞悬液在1000r/min离心5min后弃去上清液,收集细胞，加入5ml低渗液用吸管吹打均匀，室温下低渗45mino1.3.4固定低渗后的细胞，打匀后加1・5ml卡诺固定液固定30min,离心1500r/min,5min,弃上清液,加4m］卡诺固定液固定20min,离心，反复两

5、次。第3次固定后弃上清液,加少量固定液制成约0.5ml的悬液，低温下保存过夜。1.3.5滴片滴片前离心1500r/min,5min,加卡诺固定液0.5ml,将细胞吹打均匀。冷滴片：洁净的载玻片冷冻24h,吸取细胞悬液在45度倾斜的玻片上滴2〜3滴，并轻轻吹动，使细胞铺散开。然后将铺散细胞的玻片斜放静置，在酒精灯上过几次使其干燥（火焰干燥法）。热滴片：洁净的载玻片在50°C'

6、«预热20min,滴片方法同冷滴片。1.3.6染色Giemsa染液染色：用磷酸盐缓冲液（PH二7.2）将Giemsa原液按9：1稀释，配成工作液。取一•块干净的玻璃，以略小于玻片长度

7、为间距放置干净玻片作架，将待染的玻片置于染色的容器内，将染液加入，染色30-45min后取出，用自来水冲去染液，用中性树胶封片，烘干后即可用于观察分析。苏木精染液染色：染色前无需对染液做处理，其余过程同Giemsa染液染色过程。1.3.7镜检在显微镜下进行观察，统计并拍照。