鸡毒支原体热休克蛋白DnaK免疫反应原性的鉴定及应用

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1、鸡毒支原体热休克蛋白DnaK免疫反应原性的鉴定及应用王莉莉于艳超周长平赵雅芝潘巧张琳郝文君王秀梅辛九庆中国农业科学院哈尔滨兽医研究所兽医生物技术国家重点实验室/动物细菌病/动物支原体病创新团队吉林农业大学动物科技学院摘要：本文主要研究了重组蛋白DnaK(rDnaK)的免疫反应原性及其作为ELISA方法中诊断抗原的应用价值。将已构建的含有鸡毒支原体(MG)DnaK基因的重组质粒pET-30a-DnaK进行原核表达纯化，以多份MG的标准阳性血清和阴性血清作为一抗，进行Westernblot分析，鉴定rDn

2、aK的免疫反应原性，结果显示rDnaK与MG的阳性血清发生特异性反应，与MG的阴性血清无反应条带，表明rDnaK具有较好的免疫反应原性。将其作为包被抗原包被酶标板，用HRP标记的兔抗鸡IgG作为酶标二抗，分别对抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度及工作时间等反应条件进行了优化，建立了一种稳定检测鸡毒支原体(MG)抗体的间接ELTSA方法，并且与商品化的试剂盒比较结果显示，该方法的特异性性为95.4%,敏感性为92.6%o交叉反应性试验表明包被抗原rDnaK不与NDV、IBV、ILTV等几种常见的禽

3、呼吸道疾病的阳性血清发生交叉反应。抗体持续期试验结果显示该方法最早能在鸡群免疫MG疫苗后一周检测到MG抗体，说明该诊断方法适用于MG感染的早期检测。采用该方法检测了来自全国五个省份的568份临床样品，其结果表明MG的流行率在23%〜51%之间，对我国MG的流行状况做了初步的调查。关键词：鸡毒支原体;DnaK;免疫原性;间接ELISA;作者简介：王莉莉(1989-),女，河南商丘人，硕士研究生，主要从事动物支原体致病机理和诊断方法的研究.作者简介：王秀梅，E-ma订:xmwang99@163.com;作

4、者简介：辛九庆，E-mail:xinjiuqing2001@126.com收稿日期：2017-11-21基金：基金项目：2017兽医牛物技术国家重点实验室动物支原体创新团队经费IdentificationoftheimmunogenicityandapplicationoftheheatshockproteinDnaKofMycoplasmagallisepticumWANGLi-liYUYan-chaoZHOUChang-pingZHAOYa-zhiPANQiaoZHANGLinHAOWen-jun

5、WANGXiu-meiXINJiu-qin£InnovQtionteamofAnimalMycoplasmaDisease,DivisionofAnimalDiseases,StateKeyLaboratoryofVeterinaryBiotechnology,HarbinVeterirmryResearchInstitute,ChineseAcademyofAgriculturalScience;CollegeofAnimalScienceandTechnology,JilinAgricultura

6、lUniversity;Abstract：ThemainaimofthisreserachwastostudytheimmunogenicityofrDnakandtheapplicationvalueascoatingantigeninELISA.TherDnakofmycoplasmagal1isepticum(MG)wasexpressedinE.coliwiththerccombinemtplasmidpET~30a-【)netK.TheproductwasanalyzcdbyWesternb

7、lotwithMGpositiveandnegativeserumandtheresultshowedthatithadastrongimmunogenicitywithpositiveserumandcouldnotreactwithnegativeserum.ThenthepurifiedrDnakwasusedascoatingantigenforELTSAandHRP~taggedrabbitanti-chickenTgGasthesecondantibody,theconcentration

8、ofcoatingantigen,dilutionofserasampleandsecondantibodywereoptimizedaswellastheirworkingtime.Asaresult,astableandspecificindirectELTSAfordetectingMGTgGantibodywascstablished.ThediagnosticspecificityandsensitivityoftheindirectELISA