鸡毒支原体伴侣蛋白groel生物活性检测及免疫特性研究

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1、鸡毒支原体伴侣蛋白GroEL生物活性检测及免疫特性研究ImmunologicalandFunctionalCharacterizationofChaperoninGroELinMycoplasmagallisepticum研究生：胡美容专业：预防兽医学导师：高崧教授，丁铲研究员扬州大学兽医学院2012年5月胡美容：鸩毒支原体伴侣蛋白GroEL生物活性检测及免疫特性研究鸡毒支原体伴侣蛋白GroEL生物活性检测及免疫特性研究硕士研究生：胡美容导师：高崧教授、丁铲研究员摘要鸡毒支原体(Mycoplasmagallisepticum，MG)

2、是一种能引起家禽发生高致病性慢性呼吸道疾病的病原体。该病原体主要利用疫苗进行控制，目前常使用灭活的病原体或弱毒菌株。但它们仍存在潜在的危险，灭活不完全的病原体可以直接致病，弱毒苗也存在毒力返强的危险。免疫蛋白组学的出现为更加理性的设计疫苗提供了可能。由于支原体多种膜蛋白具有强的免疫原性，若直接用全菌蛋白进行免疫蛋白组学研究，大量胞浆蛋白可能混迹其中，这些蛋白一般难以刺激机体产生具有保护效价的抗体，从而使得后续分析变得异常复杂。因此，本研究拟利用免疫蛋白组学筛选MG膜相关蛋白中具有较好免疫原性的抗原。这对于寻找新的MG疫苗候选抗原具有

3、着重要的理论和实际价值。(1)鸡毒支原体RIoW株膜蛋白的免疫蛋白组学研究常规提取MGRl。w株的膜蛋白，运用免疫蛋白组学方法，筛选出与MGR1。w株兔多克隆抗体和鸡多克隆抗体血清呈双阳性反应的蛋白点，将蛋白从对应胶中切出，进行MALDI．TOF．MS分析。结果共鉴定出14种免疫原性蛋白，还有两种蛋白无法鉴定，通过BLAST比对，这些蛋白在不同支原体中的同源性都非常高。这14种蛋白中，EF—TU，丙酮酸脱氢酶系E2在支原体中已有报道其具有免疫原性；GroEL、DnaK和磷酸甘油变位酶(PGM)在其他细菌中已被证实其具有免疫原性；翻译

4、延伸因子(greA)、支链a．酮酸脱氢酶E2、丙酮酸脱氢酶系Ela亚基及Triggerfactor都有其相关功能的研究，但至今还没有其免疫原性方面的报导；其余四种蛋白未见任何报导。本实验首次通过免疫蛋白组学方法对MG膜蛋白进行分析，获得的免疫原性蛋白为下一步进行MG亚单位疫苗研究和致病性研究奠定了基础。(2)GroEL蛋白的生物活性检测为了验证鸡毒支原体的GroEL是否具有其他细菌中GroEL的生物学功能，本研究克隆并表达了MGR1。w株groEL基因，对表达产物的ATP酶活性、复性功能及抗热应激活性进行研究。结果证明，MGGroE

5、L蛋白属于保守的热休克蛋白，具有ATP酶活性，有蛋白扬州大学顺卜学位论文II一复性功能并且具有抗热应激活性。(3)鸡毒支原体GroEL蛋白免疫特性研究多种病原微生物GroEL蛋白都具有免疫原性。为评估MGGroEL蛋白的免疫保护性，本研究首先检测GroEL抗体的杀菌活性，结果发现：GroEL抗体具有明显的杀菌活性(48．9％)，将GroEL纯化蛋白作为亚单位疫苗接种SPF鸡，利用鸡毒支原体强毒株Rl。w进行攻毒，检测指标包括：存活率、病原分离、气囊病变指数、组织病理变化、抗体水平等。结果发现：GroEL免疫组鸡群虽然不能阻止MG在气

6、管内增殖(气管拭子分离率100％)，但是，对比MG攻毒组(PBS对照组)，平均气囊病变指数明显降低，气管和肺脏组织病变程度显著降低，尤其是在鸡毒支原体感染早期(7d)，呼吸道无明显病变特征。这说明GroEL能产生良好的免疫保护作用。该研究结果提示：GroEL是-,00潜在的疫苗候选抗原。这为开发其作为疫苗佐剂奠定了基础。关键词：鸡毒支原体；GroEL；伴侣蛋白；生物活性；免疫特性ImmunologicalandFunctionalCharacterizationofChaperoninGroELinMycoplasmagallise

7、pticumGraduateCandidate：MeirongHuMentors：Prof．SongGaoandChanDingAbstractMycoplasmagallisepticumisanimportantpathogenandinducesseverechronicrespiratorydiseaseinpoultry．Currentvaccinesincludeinactivatedbacterinorattenuatedstrains·Onedisadvantageisthatthepathogenhasapoten

8、tialchancetobeexposed．Toattenuatedvaccine，itexistsfbrawholelifeinvivotointerruptthevaccinationofotherdiseases，whichin