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1、肿瘤相关抗原MAGE-A1,A2,A3,A4在原发性肝癌组织中表达的研究游泳孙巍石刚朱兴宋铎(沈阳市第四人民医院肝胆外科辽宁沈阳110031)【摘要】R的研究黑色素瘤抗原MAGE-A1,A2,A3,A4基因在原发性肝癌(HCC)组织屮的表达，探讨MAGE-A1,A2,A3,A4基因与HCC患者临床指标的关系。方法RT-PCR方法检测30例HCC患者癌组织及相应癌旁组织MAGE-A1,A2,A3,A4基因表达。结果30例HCC患者癌组织+MAGE-A1,A2,A3,A4基因表达的阳性率分别为40%,13%,47%和17%显著高于癌
2、旁组织(0)(P<0.01)o统计学分析显示HCC患者癌组织屮MAGE-A1,A2,A3,A4基因表达的阳性率与患者性别、年龄、有无包膜以及乙型肝炎病毒感染等指标均无关(P>0.05)；MAGE-A1和MAGE-A3的表达与肿瘤大小及AFP水平均存在相关性(P<0.05)o结论MAGE・A1,A3在HCC屮特异性高表达，可以用于HCC的免疫治疗。【关键词】肝癌黑色素瘤抗原基因逆转录聚合酶链反应【屮图分类号】R730.2【文献标识码】A【文章编号】2095-1752(2014)16-0221-02黑色素瘤抗原(M
3、AGE)基因编码肿瘤相关抗原，可被H身特异性杀伤性T淋巴细胞识别，应用MAGE基因的这一特性制备抗原肽疫苗，用于多种恶性肿瘤的预防和治疗[1,2]o我们应用RT-PCR法对MAGE-A1,A2,A3,A4基因在HCC中的表达进行检测，为利用MAGE基因对HCC患者免疫治疗提供理论依据。材料与方法1材料1.1组织标本对彖选取2011年1月・2013年6月沈阳市第四人民医院肝胆外科收治的HCC患者30例，伴有乙型肝炎病毒阳性26例。其中男女比例为2:3,年龄38-72岁，平均56.3岁。全部患者均行手术完整切除病灶，并经术后病理证实
4、，切缘均阴性。病灶切除后，先距肿瘤边缘3cm以外切取癌旁组织，再取癌组织，分别切成直径约lcm的小块，・80°C冻存备用。另取正常的睾丸组织（沈阳市第四人民医院病理科）作为阳性对照。1.2引物根据Genbank数据库中所查MAGE-A1,A2,A3,A4基因序列，使用Omiga2软件设计引物（表1）。表IMAGE・A：L,A2,A3,A4基因mRNART・PCR弓
5、物注:F表示上游引物，R表示下游引物1.3试剂Trizol试剂购自美国Gibco公司，脱氧核昔酸（dNTPs）购自Pharmacia公司‘RNA逆转录酶（MMLV）和
6、TaqDNA聚合酶购自Promega公司。2方法2.1总RNA提取取100mg在-80°C保存的组织，于液氮中研成碎末后，迅速加入Trizol试剂lml裂解，经三氯甲烷分层、异丙醇沉淀,75%乙醇洗涤干燥后，将所得RNA溶于无RNA酶的纯水中，采用紫外分光光度计（Beckman公司・1DU640）对其定量后再分别进行cDNA合成和RNA电泳。2.2cDNA合成稀释RNA至lμg/μL,逆转录合成cDNA（25μL反应体系）:按试剂盒操作说明进行,37°C反应1.5h,94°C灭活6min,得到cDNA。2.3R
7、T-PCR2μLcDNA在各自引物引导下分别PCR扩增（25μL反应体系）：加17μL双蒸水、2.5μL10×buffer^1.5μLMgCL2、1μLdNTPs、lμL引物、0.1μLTaq酶。循环参数为94°C变性45s,55°C退火45s,72°C延伸60s,35个循环后72°C延伸5min。MAGE-A3退火用54°C,MAGE-A1,A2,A4均为63°C。每次反应都用β-actin作阳性内参照，用正常睾丸做阳性外参照。5μLPCR产物行1.5
8、%琼脂糖凝胶电泳，Kodak凝胶图像分析系统摄图片。2.4肝炎病毒、AFP检测本实验采用ELISA方法检测乙肝病毒表面抗原、AFP水平。2.5统计学方法使用SPSS10.0软件建立数据库,χ2检验和四格表确切概率法，设P<0.05表示其差异具有统计学意义。结果1.1MAGE基因在HCC中的表达情况RT-PCR电泳显示：所有内参照均为阳性。阳性对照的MAGE带显示良好.而空白对照均无任何背景。癌旁组织中均未检测到MAGE-A1,A2,A3?A4的表达。MAGE-A1A2,A3,A4扩增产物见图1。30例HCC患者癌组
9、织中MAGE・A1基因表达的阳性率为40%(12/30),MAGE-A2基因表达的阳性率为13%(4/30),MAGE-A3基因表达的阳性率为47%(14/30),MAGE-A4基因表达的阳性率为17%(5/30)均显著高于癌旁组织(0)(P<0.01)o
