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1、微生物的分离纯化及鉴定一、基本原理微生物的分离纯化是研究微生物的基木方法。将特定的微生物个体从群体屮或从混杂的微住物群体屮分离出來的技术叫作分离；在特定环境小只比1种來白同一祖先的微牛物祥体生存的技术叫作纯化。为了获得某种微牛物的纯培养，一般是根据该微牛•物对营养、酸碱度、氧筹条件要求不同，而供给它适宜的培养条件，或加入某种抑制剂造成只利于此菌牛长，而抑制其他菌牛长的环境，从而淘汰其他一些不需要的微牛物，再用稀释涂布平板法或稀释混合平板法或平板划线分离法等分离、纯化该微生物，直至得到纯菌株。土壤是微生物生活的大本营，在这里生活的微纶物无论是数量和种类都是极其多样的，因此，土壤是我们开发利用微
2、牛•物资源的重要基地，可以从其中分离、纯化到许多有用的菌株。二、实验器材1、培养基：高氏1号琼脂培养基，牛肉膏蛋白腺琼脂培养基，马丁氏琼脂培养基，PDA培养基2、其他：盛9ml无菌水的试管，盛90ml无菌水并带有玻璃珠的三角烧瓶，无菌玻璃涂棒，无菌吸管，接种环，10%酚,无菌培养皿，无菌室，培养箱,高压蒸汽灭菌锅，记号笔等3、材料：土壤(若未分离出想要得到的菌，则再加其他材料)三、培养基的配方及配制步骤1、高氏1号培养基(1000ml,培养放线菌):可溶性淀粉(20g),KNO3(1g),K2HPO4(0.5g),MgSO4-7H2O(0.5g),NaCI(0.5g),FeSO4-7H2O(
3、0.01g),琼脂20g,pH=7.4-7.6,121°C灭菌20mino和改良的差别就在于有没有FeSO4・7H2O高氏常常配完后变成褐色也是山于Fe2+氧化为Fe3+的关系，所以常常有人用螯合的FeSO4,防止氧化。称虽和溶化按配方先称取可溶性淀粉，放入小烧杯中，并用少虽冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需其他备类培养基水最的沸水屮，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化。然后再称取其他各成分，并依次溶化，対微量成分FeSO4.7H2O可先配成高浓度的贮备液，按比例换算后再加入。待所有试剂完全溶解后，补充水分到所需的总体积。配制固休培养基时，将称好的琼脂放入已溶的试剂中，在加热融化，最后补充所损失
4、的水分。2、牛肉膏蛋白月东培养基(1000ml,分离细菌)牛肉膏0.5g蛋白陈ig氯化钠0.5g琼脂2g蒸溜水100mLpH7.0〜7.2灭菌1.05kg/cm2,22min按培养基配方比例依次准确地称取牛肉膏、蛋白腺、NaCI放入烧杯屮。牛肉膏常用玻棒挑取，放在小烧杯或表面皿中称量，用热水溶化后倒入烧杯。也可放在称虽纸上，称量后直接放入水屮，这时如稍微加热，牛肉膏便会与称最纸分离，然后立即取出纸片。蛋白豚很易吸潮，在称取时动作要迅速。在上述烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后,在石棉网上加热使具溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。如果配制固体培养基，将称好的琼脂放入
5、已溶化的药殆屮，再加热溶化，在琼脂溶化的过程屮，需不断搅拌，以防琼脂糊底使烧杯破裂。最后补足所失的水分。3、马丁氏培养基（1000ml,分离真菌）KH2PO41gMgSO4-7H2O0.5g蛋白腺5g葡萄糖10g琼脂15—20g水1000mlpH然此培养液1000ml加1%孟加拉红水溶液3.3ml。临用时每100ml培养基屮加1%链霉素液0・3mlo4、PDA培养基（1000ml,分离真菌）马铃薯300克葡萄糖20克琼脂15-20克自来水1000毫升自然PH其做法是先洗净去皮，再称取300g马铃薯切成小块，加水煮烂（煮沸20~30分钟，能被玻璃棒戳破即可），用四层纱布过滤，再据实际实验需要加
6、葡萄糖和琼脂，继续加热搅拌混匀，稍冷却后再补足水分至1000毫升，分装试管或者锥形瓶，加塞、包扎，（121°0灭菌20分钟左右后取出试管摆斜面或者摇匀，冷却示贮存备用。四、样品的采集（根据要培养的菌种选择所需的样品，样品要含有实验所需的菌种，如土壤中含有放线菌）土壤采集：选择肥沃的土壤，去表层2-3cm,用铲了向下挖3-1Ocm的土壤，用已灭好菌的密封袋装好。（本组采用学校大门左边小树林的土壤）五、分离与纯化的方法A、稀释涂布平板法1.样品稀释液的制备准确称取待测样品IOg，放入装有90ml无菌水并放有小玻璃珠的250ml三角瓶中,用手或置摇床上振荡20min,使微生物细胞分散,静置20-3
7、0s,即成稀释液；再用1ml无菌吸管，吸取稀释液Iml,移入装有9ml无菌水的试管中，吹吸3次，让菌液混合均匀，即成10-2稀释液；再换一支无菌吸管吸取10-2稀释液1ml,移入装有9ml无菌水的试管中，也吹吸三次，即成10・3稀释液；以此类推，连续稀释，制成10-4、10-5、10-6等一系列稀释菌液。用稀释平板汁数吋，待测菌稀释度的选择应根据样站确定。样晶中所含待测菌的数暈多时，稀露度应高，反之则低。通常
