人用狂犬病疫苗效价测定法(nih法)附疫苗(vero细胞+地鼠肾细胞)技术资料

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1、人用狂犬病疫苗效价测定法(NIH法)本法系将供试品免疫小鼠后，产生相应的抗体，通过小鼠抗体水平的变化测定供试品的免疫原性。试剂稀释液(PBS)量取0.9%磷酸二氢钾溶液75ml>2.4%磷酸氢二钠(Na2HPO4•12氏0)溶液425ml、&5%氯化钠溶液500ml,混合后加水至5000ml,调pH值至7.2〜8.0。攻击毒株CVS制备启开毒种，稀释成ICT悬液，接种11〜13g小鼠，不少于8只，每只脑内接种0.03ml,连续传2〜3代，选择接种4〜5天有典型狂犬病症状的小鼠脑组织，研磨后加入含2%马血清或小牛

2、血清制成20%悬液，经每分钟1000转离心10分钟，取上清液经病毒滴定(用10只18〜20g小鼠滴定)及无菌检查符合规定后作攻击毒用。参考疫苗的稀释参考疫苗用PBS稀释成1：25、1:125和1:625等稀释度。供试品溶液的制备供试品用PBS做5倍系列稀。测定法用不同稀释度的供试品及参考疫苗分别免疫12〜14g小鼠16只，每只小鼠腹腔注射0.5ml,间隔1周再免疫1次。小鼠于第一次免疫后14天，用经预先测定的含5〜100个L%的病毒量进行脑内攻击，每只0.03mlo同时将攻击毒稀释成10°、1010吃和10’

3、进行毒力滴定,每个稀释度均不少于8只小鼠。小鼠攻击后逐日观察14天，并记录死亡情况，统计第5天后死亡和呈典型脑症状的小鼠。计算供试品和参考疫苗EDso值。计算相对效力P=T/SXdT/dsXD式中P为供试品效价，lU/ml;T为供试品E%的倒数；S为参考疫苗EDso的倒数；山为供试品的一次人用剂量，ml；ds为参考疫苗的一次人用剂量，ml；D为参考疫苗的效价，lU/ml。【附注】(1)动物免疫时应将疫苗保存在冰浴中。(2)各组动物均应在同样条件下饲养。(3)攻击毒原病毒液(10°)注射的小鼠应80%以上死亡。人

4、用狂犬病疫苗(Vero细胞)RenyongKuangquanbingYimiao(VeroXibao)RabiesVaccineforHumanUse(VeroCell)本品系用狂犬病病毒固定毒接种Ve「o细胞，经培养、收获、浓缩病、病毒灭活、纯化后，加入适宜的稳定剂后制成，用于预防狂犬病。1基本要求生产和检定用设施、原材料及辅料、水、器具、动物等应符合“凡例"有关要求。2制造2」生产用细胞生产用细胞为Vero细胞。2.1.1细胞的管理及检定应符合“生物制品生产和检定用动物细胞基质制备及检定规程,,规定。各细胞

5、种子批代次应不超过批准的限定代次。取自同批工作细胞库的1支或多支细胞管，经复苏扩增后的细胞仅用于一批疫苗的生产。2.1.2细胞制备取工作细胞库中的1支或几支细胞管，细胞复苏、扩增至接种病毒的细胞为一批。将复苏后的单层细胞用膜蛋白酶或其他适宜的消化液进行消化，分散成均匀的细胞，加入适宜的培养液混合均匀，置37°C培养成均匀单层细胞。2.2毒种2.2.1名称及来源生产用毒种为狂犬病病毒固定毒CTN-1V株、aGV株或其他经Vero细胞适应的狂犬病病毒固定毒株。2.2.2种子批的建立应符合“生物制品生产和检定用菌毒种

6、管理规程,,规定。各种子批代次应不超过批准的限定代次。狂犬病病毒固定毒CTN-1V株在Vero细胞上传代建立工作种子批传代次数应不超过35代，aGV株在Vero细胞上传代建立工作种子批传代次数应不超过15代。2.2.3种子批的检定主种子批应进行以下全面检定，工作种子批应至少进行2.2.3.1-2.2.3.4项检定。2.2.3.1鉴别试验用小鼠脑内中和试验鉴定毒种的特异性。将毒种作10倍系列稀释，取适宜稀释度病毒液与等量狂犬病病毒特异性免疫血清混合，同吋设立正常血清对照组，试验组与对照组的毎个稀释度分别接种ll-

7、13g小鼠6只，每只脑内接种0.03ml,观察14天，中和指数应不低于500o2.2.3.2病毒滴定取毒种作10倍系列稀释，每个稀释度脑内接种体重为ll-13g小鼠至少6只，毎只脑内接种0.03ml,观察14天，病毒滴度应不低于7.5LgLD50/mlo2.2.3.3无菌检查依法检查（附录XIIA）,应符合规定。2.2.3A支原体检查依法检查（附录XIIB）,应符合规定。2.2.3.5病毒外源因子检查依法检查（附录XIIC）,应符合规定。2.2.3.6免疫原性检查用主种子批毒种制备灭活疫苗，腹腔注射体重为12-

8、14g小鼠，每只0.5mlo7天后重复接种1次作为试验组，未经免疫小鼠做对照组。第一次免疫后的第14天，试验组和对照组分别用10倍系列稀释的CVS病毒脑腔攻击，每只0.03ml,每个稀释度10只小鼠。保护指数应不低于100。2.2.4毒种保存毒种应置一60°C以下保存。2.3原液2.3.1细胞制备同2」.2项。2.3.2培养液培养液为含适量灭能新生牛血清的MEM、199或其他适宜培养液