共聚焦激光显微镜技术

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1、激光共聚焦显微镜技术绪论激光共聚焦显微镜技术(ConfocalLasersScanningMiccruscopeCLSM)是将显微镜技术与激光技术有效的结合，对具有荧光标记的物的形态及功能，通过计算机控制可以对其单层面进行快速扫描，也可以对多个层面进行连续光片层扫描。逐层获得二维光学横断面图像，并可通过计算机三维重组软件支持，获得真三维图像。激光共聚焦显微镜汇集了激光技术、显微镜技术、免疫荧光技术、计算机及图像处理技术、精密的机械技术等，高、精、尖细胞分析及工程技术于一体的新技术。使其成为形态学、分子细胞生物学、神经科学、药理学、遗传学等领域中新一代强有力的研究工具。我们大家知道，从人

2、类制作的第一台显微镜到现在以有几百年的历史来了，随着人类对生命科学研究的不断深入，各种显微镜应运而生，使得研究细胞的手段以更加精密化和多样化。共聚焦显微镜的理论是在1957年MarvinMinsky提出的，但共聚焦显微镜作为商品推出是在20世纪80年代初期，早期的激光共聚焦显微镜在技术上很不完善，其应用也受到限制。至到20世纪80年代末，光学系统设计不断改进，成像的质量和灵敏度都有所提高，进入90年代初，激光共聚焦显微镜系统中逐步引入混合激光和紫外激光技术。90年代末由美国Meridian公司推出的新型激光共聚焦显微镜系统，已具备完善的光学系统，模块化的仪器设计，灵活的软件和高配置的计

3、算机硬件，从而使共聚焦显微镜系统的功能不断升级，应用的领域不断扩展。随着生命科学研究的不断深入及荧光探针技术的迅速发展，共聚焦显微镜将推动生命科学研究的迅速发展，同时生命科学研究的进展也将使激光显微镜技术不断改进和完善。激光共聚焦显微镜是现今最为先进的光学显微镜，其主要优点为：以激光为光源，在相应的荧光探针标记后，对样本进行逐点扫描，逐层获得二维光学横断面图像，具有“细胞CT”的功能，并可通过计算机三维重建软件支持，获得真三维图1,并可以任意角度旋转，观察细胞，组织立体形态和空间关系；可以对活细胞和组织进行无损伤的观察，动态测量细胞内的Ca离子浓度和pH值等活细胞生理信息；可对细胞膜的

4、流动性，细胞间通讯，细胞融合，细胞骨架弹性测量等，可用作“光刀子”完成细胞内“外科手术”。这一技术使得对活细胞和组织进行原位，动态，定量的观察和测量的梦想成为现实。第一章光学显微镜显微镜的基本原理我们大家知道，“工欲善其事，必先利其器”光学显微镜不仅是发现细胞的必要手段，也是生命科学研究基本技术条件。第一节普通显微镜的基本结构和原理普通显微镜利用光线照明，标本中的各点以其光吸收（即光的振幅发生变化）的不同而在明亮的背景中成像。它是由光学系统；机械系统；光源组成。（—）光学系统1•目镜它是插在目镜筒顶部的镜头，由一组透镜组成，可以使物镜成倍地分辨、放大物像，例如10X.15X等。按照所能

5、看到的视场大小，目镜可分为视场较小的普通目镜，和视场较大的大视场目镜（或称广角目镜）两类。较高档显微镜的目镜上还装有视度调节机构，操作者可以方便快捷地对左右眼分别进行视度调整；此外，在这些目镜上可以加装测量分划板，测量分划板的象总能清晰地调焦在标本的焦面上；并且，为了防止目镜被取走以及减少运输中被损坏的可能性，这些目镜可以被锁定。2.物镜它安装在转换器的孔上，也是由一组透镜组成的，能够把物体清晰地放大。物镜上刻有放大倍数，主要有10X.20X、40X、60X100X等。高倍物镜中多采用浸液物镜，即在物镜的下表面和标本片的上表面之间填充折射率为1.4左右的液体（如杉木油），它能显著的提高

6、显微观察的分辨率。物镜的主要参数:放大率放大率就是放大倍数，是指被检验物体经物镜放大再经目镜放大后，人眼所看到的最终图象的大小对原物体大小的比值。是物镜和目镜放大倍数的乘积。放大率也是显微镜的重要参数，但也不能盲目相信放大率越高越好，在选择时应首先考虑物镜的数值孔径。数值孔径:数值孔径简写NA,数值孔径是物镜和聚光镜的主要技术参数，是判断两者（尤其对物镜而言）性能高低的重要标志。其数值的大小，分别标科在物镜和聚光镜的外壳上。数值孔径（NA）是物镜前透镜与被检物体之间介质的折射率（h）和孔径角（u）半数的正玄之乘积。用公式表示如下:NA=hsinu/2孔径角又称“镜口角”，是物镜光轴上的

7、物体点与物镜前透镜的有效直径所形成的角度。孔径角越大，进入物镜的光通亮就越大，它与物镜的有效直径成正比，与焦点的距离成反比。显微镜观察时，若想增大NA值，孔径角是无法增大的，唯一的办法是增大介质的折射率h值。基于这一原理，就产生了水浸系物镜和油浸物镜，因介质的折射率h值大于一，NA值就能大于一。数值孔径最大值为1.4,这个数值在理论上和技术上都达到了极限。目前，有用折射率高的漠荼作介质，漠荼的折射率为1.66,所以NA值可大于1.4。这里必须指