生化试验（吉林大学）生化实验报告1

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1、一、实验目的：1、熟悉工作曲线的制作方法及注意事项；2、常握3,5■二硝基水杨酸（DNS）比色定糖的原理和方法;3、学握Folin-B法测定蛋白质含量的原理和方法；4、掌握酶蛋白分离提纯的原理；5、掌握酶的比活力测定及其计算方法；6、掌握酶促反应动力学屮用双倒数法测定Km的方法；7、运用正交试验法确定温度、pH值、离子浓度的最适条件。称量技术：1、了解电子天平的用途2、了解电子天平的工作原理3、掌握电子天平的使用方法4、常握电子天平使用前后的注意事项离心技术：1、了解离心机的基本原理和用途2、了解离心机的类型和用途3、了解离心机的型号和控制版面4、掌握离心机的使用方法5、学握离心机使

2、用的注意事项层析技术：1、了解层析技术的基本原理2、了解层析技术的分类情况3、了解各种层析技术的原理4、学握凝胶层析技术光谱分析技术：1、学习掌握紫外可见、荧光、红外光谱分析技术原理2、了解仪器结构和分类3、熟练常握常用仪器的使用方法和注意事项电泳技术：1、了解电泳的基本原理2、了解电泳的类型3、学习SDS-PAGE测定蛋白质分子量的原理4、掌握垂直板电泳的操作技术5、掌握琼脂糖凝胶电泳的操作技术6、了解转移电泳的基本原理和操作方法7、了解双向电泳的基本原理和操作方法二、实验原理：1、蔗糖酶的提取：①酵母菌的基本特征：单细胞，椭圆形、圆形或柱形。长5・30um,宽l・5um。②生物材

3、料破碎方法：（1）机械（匀浆）法①研钵②玻璃或Teflon研棒匀浆器（50mL）Teflon：聚四氟乙烯先将剪碎的组织置于管屮，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机高，适用于少量组织和脏器。③高速组织捣碎机（0.5-1L）将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。④高压匀质机（XL）高压下的细胞通过阀门流出时，细胞内外压力同时降低，但由于细胞膜的作用，胞外压力瞬间降至常压，而胞内压力相比之下降低较慢，从而在细胞内外形成压力差，使细胞膜破裂

4、。优点：快速，产热小，对蛋白损伤小，破碎效率高。一次破碎效率可达90%以上（2）超声波处理法用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，常在30至60Hz频率下处理10J5分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施。（3）反复冻融法将细胞在・20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内的水形成冰粒而剩余的细胞液中盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。设备简单、效率不高，时间长，注意蛋白酶！（4）化学处理法冇些动物细胞町采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏。（5）溶胞作用（酶溶解法）用生物酶将细胞壁和细胞膜消化溶解的方

5、法。常用的溶酶有溶菌酶、3-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等。（6）自溶法将新鲜的生物材料存放于一定的pH和适当的温度下，细胞结构在自身所具有的各种水解酶（如蛋口酶和酯酶等）的作用下发生溶解，使细胞内含物释放出来。2、蔗糖酶的纯化：①酶与蛋白质纯化过程的独有特点：（1）特定的一种酶在细胞内的含量很少……纯化困难（2）可以通过测定活力的办法加以跟踪……寻找关键②酶的纯化方法：1.酶的蛋白属性；两性电离：蛋白质分子除两端的氨基和竣基可解离外，氨基酸残基侧链川某些基团，在一定的溶液pH条件下都可解离成带负电荷或正电荷的基团。等电点（isoelectricpoint,pl）：当蛋白质溶液处于某一p

6、H时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此吋溶液的pH称为蛋白质的等电点。大分子（胶体）：分子量可自1万至100万之巨，其分子的直径可达1〜lOOnm,为胶粒范围之内。稳定的因素：□颗粒表面电荷□水化膜2.调节酶溶解度的方法；有机溶剂分级沉淀（1）改变离子强度；盐析硫酸镀分级沉淀（反抽提法）反抽提法（BackExtraction）例：E.coliRNA聚合酶42%・50%硫酸钱饱和度时沉淀通常方法：先33%再50%反抽提法：再42%将包含待分离酶在内的多种蛋白一起先沉淀出来，然后再选择适当的递减浓度的硫酸钱溶液来抽提沉淀物。蛋白从溶液中沉淀析出十分容易，沉

7、淀在溶液中溶解有高特异性。(2)改变pH或温度；改酶变在介未电纯常化数之；前PI也是未知的，pH不宜变化过大，以免失活。Cu,Zn-SOD的纯化可在70oC,10min。(3)改变介电常数；有机溶剂分级沉淀：向水溶液中加入一定量亲水性的有机溶剂，降低溶质的溶解度，使其沉淀析出的分离纯化方法。亲水性有机溶剂加入溶液后降低介质的介电常数，使溶质分子之间的静电引力增加，聚集形成沉淀。亲水性有机溶剂的水合作用降低了自由水的浓度，压缩了表面水化膜的厚度，降低其亲水性