微生物方法学验证培训

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1、微生物方法学验证培训包括：1•细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证准确性（回收率）2•控制菌检查法的验证专属性3•实例讲解1细菌、霉菌及酵母菌计数方法的验证1.验证的目的：确认所采用的方法适合该药品的细菌、後菌及酵母菌数的测定。照此检测法和检验条件进行供试品细菌、霉菌及酵母菌数检查，能保证结果的准确、可靠。2.验证的步骤：根据样品的特性，制定检验方法和检验条件保证验证试验所采用的仪器、试剂、培养基均符合要求按制定的方法进行试验根据结果判断是否符合验证标准验证时，按供试液的制备和细菌、霉菌及酵母菌计数所规定的方法及要求进行。验证试验至少进行3次独

2、立平行试验，并分别计算各试验菌每次试验的回收率。3.验证用菌珠：细菌计数验证用大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽抱杆菌霉菌及酵母菌计数验证用白色念珠菌、黑曲霉加菌量50~100CFU4.验证方法的选择：平皿法（包括稀释法）、薄膜过滤法、中和法、离心沉淀法、联合方法5.样品稀释级的选择：最低稀释级lg或lml6.培养基：营养琼脂、玫瑰红纳琼脂、改良马丁培养基、营养肉汤培养基、改良马丁琼脂培养基7.菌液制备：接种金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽抱杆菌的新鲜培养物至10ml营养肉汤中,30-35°C18~24h,取此培养物1ml加0.9%无菌氯化

3、钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法，稀释至10-5〜10-7,使菌数约为50〜100CFU/ml。接种白色念珠菌的新鲜培养物至10ml改良马丁培养基屮，23〜28°C24〜48h,取此培养物1ml加0.9%无菌氯化钠溶液9ml,采用10倍递增稀释法，稀释至10-5^10-7,使菌数约为50〜100CFU/ml。接种黑曲霉的新鲜培养物，至改良马丁琼脂斜面上，23~28°C5~7天，加3〜5ml0.9%无菌氯化钠溶液洗下每菌抱子，吸出菌液，取lml菌液加0.9%无菌氯化钠溶液9inl,采用10倍递增稀释法，稀释至10-4-10-6,使菌数约为5

4、0~100CFU/ml。&供试品的处理：固体10g供试品+稀释剂至100ml液体10ml供试品+稀释剂至100ml分为菌液组、供试品对照组、试验组、稀释剂对照组菌液计数方法10410'0.1ml/0.1ml0.1ml/、/平皿平皿平皿注意：平皿是倒好的，己经培养一段时间的，可防止过多的水分，直接吸0-lml,转匀，用接种坏均匀涂开。O［吸管伸入液面下.吹岀,十倍稀释法，具体稀释到何种级别，需要通过平皿计数后，才可确定。实际操作中，第一步,10-1的级别，从菌原液中，吸lml到9ml生理盐水中，有的是吸0.1ml到9.9ml生理盐水中，视

5、菌浓度而确定。实际操作中，十倍递增稀释法，操作繁琐，用到的试管及多，费时，下面讲述两管法进行菌液的计数。操作简便，省时省力。两管法只是我们的经验方法，不能作为书而记录中的方法记载，记录中仍写的是十倍递增稀释法。而黑曲霉我们不用两管法，后面有讲述。菌原液笫一管第二管相当于1尸相当于10"10ml无菌氯化啊毓10ml无菌氯化钠溶液/禽秋两管法中，生理盐水的量也是视浓度而定，有的是51111,有E、彳皿计数后的结果，做相应的调整。两管法中，吸収0.1ml至已经倒好培养基的平皿中，转匀，再用接种针均匀涂开。如果平皿上长8CFU的菌，那么菌浓度

6、为80CFU/mlo做验证Z前，头天先必须摸索出菌液的浓度，点计菌数Z后，就可以制出50〜100CFU的菌悬液，同时做验证试验。黑曲霉计数：収孑包子悬液，套一环至100ml含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，再吸取0.1ml至平1111中，涂布，计数。上面的含黑曲霉的100ml无菌氯化钠溶液，可以作为储备液，于2〜8°C冰箱屮，可以保存儿个月，稳定，且不会担心泡子散出。&1菌液组：测定所加的试验菌数平皿法：収试验用的lml菌液(约50~100CFU),分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行2个，测定其菌数。8.

7、2供试品对照组：取规定量供试液，按菌落计数方法测定供试品木底菌数。8.3试验组：平皿法：取可能用的最低稀释级供试液lml和50~100CFU试验菌，分别注入平皿中，立即倾注琼脂培养基，平行2个，测定其菌数。培养基稀释法(平皿法)：取可能用的最低稀释级供试液lml,分别注入n个平皿，每个平皿再注入5O~1()OCFU试验菌，平行2个，测定其菌数。如:分摊到5个平皿，那么每个平皿就注入0.2ml+lml菌液，每份平行2个平皿，共10个平皿。计算0・2ml供试液，平均菌数。同样，供试品对照组也是同法操作，不加菌液。薄膜过滤法：取可能用的最低稀释级

8、供试液，过滤，冲洗，应在最后一次的冲洗液屮加入50〜100CFU试验菌，过滤，按薄膜过滤法，测定英菌数，至少要一张膜。离心沉淀法：取可能用的最低稀释级供试液，500转/分，3mi