westernblot条带分析资料

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1、近几天回答了蛋白版几个有关压片和显影的帖子，发现在这一块还没有比较系统的论述。特贡献了western显影常见问题及解决方案，是我的经验总结，以供大家参考。其中绝大部分问题是我所遇到过的，其他个别我没遇到过的是参照pierce公司的说明书。限于字数，语言比较简洁，如对其中内容有疑问或建议可跟帖。Western荧光检测取决于抗原含量—一抗敏感度—二抗敏感度—底物敏感度—显影和定影效率这一系统。我的经历认为确保万无一失的做法是如果看到荧光则压10~30s，看不到则同时压两张，10~30min洗一张，如果无则再补一张,1h后洗。再无，则压过夜。共3张片，

2、根据每次结果调整。其中两张片子的压法如下描述:先剪一张比膜长2~3厘米的片子（以供贴胶带），然后剪2片细小透明胶带贴到片子的左右两边（贴时胶带留一半用于粘到封口膜上），然后将片子压到膜上，并使透明胶带留出的一半粘到封口膜上。这样就固定了第一张胶片，就不会因为放、取第二张胶片而使第一张移动了。然后放第二张胶片，与第一张片子贴在一起就行，注意片子要干燥，压片前用纸擦干封口膜，以避免被底物液体污染导致与下面一张粘在一起。取时用手轻轻拂过就可以把上面片子与下面一张错开了，不要用手抠，否则下面一张也移动了。在洗下面一张片子时一定要取掉粘在片子上的胶带，否则

3、在胶带的地方会影响显影。荧光经过下面一张胶片会稍微有些衰减，所以下面一张胶片感光稍微比上面一张强一些。现象---------------------原因-------------------------------解决反影(白色条带,黑色背景)-------1HRP过高(背景较高)---------------至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注1显影后膜上条带处变为黄色------2HRP过高(敏感性太高)--------------至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注2信号弱或无-----------------3HRP过高引起底

4、物迅速耗竭----------至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注3-------------------------4抗体-抗原系统敏感性过低----------提高抗体浓度/蛋白上样量*注4------------------------5转膜不充分/过转------------------优化转膜条件*注5------------------------6HRP或底物活性降低-----------------测试活性或选用敏感底物*注6高背景-------------------7HRP过高(背景较高)--------------至少

5、成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注7--------------------------8封闭时间不足------------------延长封闭时间4度过夜最好*注8-------------------------9抗体与封闭液有交叉---------------更换封闭液(如3%BSA的TBST)*注9------------------------10TBST洗脱不足------------------增加洗脱时间、次数、用量*注10-------------------------11暴光时间过长------------------

6、---降低暴光时间*注11------------------------12抗原-抗体浓度过高--------------降低抗体浓度或蛋白上样量*注12条带内无显影的白点----------------13转膜不良（如有气泡在胶-膜之间)----精细操作*注13-------------------------14膜平衡不均/油脂污染-----------按说明书平衡膜/戴手套用平头镊子持膜*注14-----------------------------15膜与X光片间有气泡--------------显影前去除气泡*注15非特异性条带--

7、----------------16抗体交叉反应------------------至少成倍稀释一抗/二抗(可4~10倍)*注16-------------------------17SDS非特异性结合蛋白条带---------使用无SDS转膜液*注17散在小圆斑-----------------18封闭液有杂质颗粒--------------------静置牛奶使大颗粒沉淀，仅用上层*注18*注1其具体问题有二：一是背景较高,二是没有条带.形成机制为条带处HRP很快将底物耗竭，则不发光不使胶片感光而为白色,周围因背景HRP较低而持续发光一段时间

8、使胶片感光为黑色。这种常见于高浓度抗体并且封闭/洗脱不好的情况下。如果没有背景则就是原因3的现象。在暗室可以看到条带周围荧光而条带处为暗