westernblot参考资料

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1、Westernblot基础知识一、原理与Southern或Northern杂交方法类似，但WesternBlot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。二、分类

2、根据凝胶电泳的类型，WB可分为：*还原（变性）WB：最常用的一类，使用SDS-PAGE电泳。主要是来检测蛋白质的特性、存在与否、蛋白质的同源性以及估计蛋白质的分子量等*非还原（非变性）WB：主要用来分析蛋白质的结构、保持蛋白的活性的。一般不使用SDS、DTT等变性剂。western显色的方法主要有以下几种：i.放射自显影ii.底物化学发光ECLiii.底物荧光ECFiv.底物DAB呈色现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下

3、（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。三、主要试剂1、29%(w/v)丙烯酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29gN，N’-亚甲叉双丙稀酰胺1g温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水至100ml终体积储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。2、十二烷基硫酸钠SDS溶液10%(w/v)SDS0.1g去离子水1ml室温保存。3、分离胶缓冲液1.5mmol/L

4、Tris-HCL(pH8.8)Trisbase18.15g1mol/LHCL48mlSW至100ml终体积过滤后4℃保存。4、浓缩胶缓冲液0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8)Trisbase6.05gSW40ml用约48ml1mol/LHCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后4℃保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。5、TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙

5、稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.6、SDS-PAGE加样缓冲液pH6.80.5mol/LTris缓冲液8ml，甘油6.4ml10%SDS12.8ml巯基乙醇3.2ml0.05%溴酚蓝1.6mlH2O32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。7、Tris-甘氨酸电泳缓冲液Tris30.3g甘氨酸188gSDS10gSW至1000ml得0.25mol/LTris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。8、转移缓冲液甘氨酸2.9g

6、Tris碱5.8gSDS0.37g甲醇200mlSW至总量1L9、丽春红染液储存液丽春红S2g三氯乙酸30g磺基水杨酸30gSW至100ml加水用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。10、脱脂奶粉5%(w/v)。11、NaN30.02%叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。12、Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。13、Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。14、过氧化物酶标记的第二抗体。15、NBT(溶于7

7、0%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。16、BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。17、100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。18、100mmol/LNaCl。19、50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/LEDTA。四、实验流程第1步：组织或细胞蛋白提取蛋白提取的质量直接决定着WB结果的好坏，因此，根据标本类型和检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的！收集106细胞，加入150μlSDS裂解液，冰上超声5次，定量。第2步：电泳、转膜电泳和转膜是保证成功进行WB后续检测的前提条件。根据不同的检测目的和待

8、测蛋白的特性，选择合适的膜类型。常用的转移膜类型有：PVDF膜、硝酸纤维素膜（NC膜）和尼龙膜