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《黄芪多糖口服吸收促进剂探究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在工程资料-天天文库。
1、黄英多糖口服吸收促进剂探究［摘要］该实验利用黄竄多糖中引入的仲氨基与FITC中氧基发生亲核反应，得到FITC荧光标记的黄英多糖,并采用Caco-2细胞模型评价了低相对分子质量壳聚糖和鱼精蛋白对黄英多糖的吸收促进作用。结果表明该荧光标记方法稳定性好，灵敏度高；低相对分子质量壳聚糖和鱼精蛋白对细胞毒性作用均较小；2种吸收促进剂对黄英多糖的吸收均具有一定的促进作用，同时吸收促进剂的比例越大时，作用越明显，低相对分子质量壳聚糖的作用略强于鱼精蛋白。实验前后细胞跨膜电阻(TEER)的变化表明其作用机制可能是吸收促进剂能暂时
2、打开细胞间的紧密连接，增加了膜的流动性，从而提高药物的透过性。［关键词］黄英多糖；FITC；Caco-2细胞模型；吸收促进剂黄茂多糖(Astragaluspolysaccharides,APS)是中药黄英的主要生物活性成分，其药理作用十分广泛，具有增强机体免疫功能、强心、抗病毒、抗肿瘤、调节血压、抗衰老、抗氧化延缓衰老等作用［1-4］o黄英多糖主要是由葡萄糖、鼠李糖、阿拉伯糖和半乳糖等重复单元连接而成，属于水溶性物质［5］,其中相对分子质量在10000〜50000的活性最强，由于黄英多糖属于生物大分子，且亲水性强
3、，因而其生物透膜性差，口服生物利用度较低[6-7]o采用吸收促进剂提高药物的生物利用度是常用且有效的手段，吸收促进剂的种类繁多，但大多数吸收促进剂的作用与其细胞毒性高度相关，不能应用于肠道[8]。本实验选择了2种低毒而有效的吸收促进剂壳聚糖（CS）和鱼精蛋白（PS）,研究其对黄英多糖的吸收促进作用。Caco-2细胞模型是被国内外广泛应用并被认可的体外吸收模型。由于在吸收过程研究中比较简单、重复性好，目前正被广泛应用于评估药物的细胞渗透性、阐明药物转运的途径等研究中[9-11]o本实验采用Caco-2细胞模型研究2
4、种吸收促进剂对黄茂多糖的吸收促进作用，从而为黄茂多糖的口服制剂的研究和发展提供实验基础。1材料二氧化碳培养箱（美国Nuaire公司）；XDS-1B倒置显微镜（重庆）；Millicell-ERS跨膜电阻仪,Milli-Q纯水机（美国M订lipore公司）；Transwell培养板（丹麦NUNC公司）;高速冷冻离心机（美国Beckman公司）；F96S荧光分光光度计（上海棱光技术有限公司）。Caco-2细胞由美国胡明博士馈赠；DMEM培养基（美国Hyclone公司）；胎牛血清（美国Equitech-Bio公司）；非必
5、需氨基酸（美国JRH公司）；异硫氧酸荧光素（FITC）,谷氨酰胺，胰蛋白酶，酪胺（美国Sigma公司）；硼氢化钠（国药集团化学试剂有限公司）；Hank's缓冲盐溶液（HBSS）和磷酸盐缓冲溶液（PBS）均自配；黄英多糖（实验室自制,纯度92.3%）；壳聚糖（CS,相对分子质量30000,浙江金壳生物化学有限公司）；鱼精蛋白（PS,德瑞生物科技有限公司）；水为超纯水，其他试剂均为分析纯。2方法与结果2.1黄竄多糖的荧光标记2.1.1APS-Tyr的合成取APS200mg溶于20mL0.2mol・L-1的磷酸钾缓冲液
6、（pH8.0）,加入酪胺（Tyr）200mg,室温下反应24ho然后加入硼氧化钠100mg,于37°C水浴中反应96h,间或振荡，反应完毕后。离心分离，将其上清液上SephadexG-25柱。用水洗脱，在280nm下检测收集的第一峰。冻干后得多糖和酪胺的合成产物APS-Tyro经SephadexG-25分子筛色谱柱分离，在280nm波长处检测各管样品的吸光度，见图1,APS在280nm波长处无特征吸收峰存在，而Tyr在280nm波长处有特征吸收峰，同时第1个峰用苯酚硫酸法测得有糖存在，而第2个峰无糖存在，初步证明
7、第1个峰既有APS又有Tyr存在，而第2个峰只含有Tyr,说明合成的APS-Tyr首先出峰，未与SEP结合的酪胺在其后出峰，APS-Tyr得到纯化。2.1.2APS-Tyr-FITC的合成［12-13］取APS-Tyr200mg溶于适量水中，用0.5mol•L-1NaHC03调pH至8.5,然后加入FITC20mg,于室温下避光反应过夜，向反应物中加入适量无水乙醇至乙醇终浓度为80%,有大量亮黄绿色沉淀析出，离心，弃去上清液，沉淀加水复溶，乙醇再沉淀，按照此操作重复3次，最后一次沉淀用少量水溶解，进一步上Seph
8、adexG~25柱纯化，收集相应水洗脱的组分，冻干保存得APS-Tyr-FITCo经FITC标记的APS-Tyr-FITC为橙红色粉末，其水溶液呈明显的黄绿色荧光。经SephadexG-25分子筛色谱柱分离，用荧光分光光度仪在激发波长495nm,发射波长510nm处检测各管样品的荧光吸收强度，见图2,APS在该波长处无特征吸收峰存在,而FITC在该处有特征吸收峰，第一个峰
