生物脱氢酶制备、纯化、活性检测和在药物筛选中应用

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1、生物脱氢酶制备、纯化、活性检测和在药物筛选中应用【摘要】脱氢酶(dehydrogenase是一类催化物质氧化还原反应的酶，是已知酶中种类最多的一类，具有极其重要的生理学意义。本文介绍了其基本的相关概念，并对其制备、纯化、活性检测方法及在药物筛选中的应用进行了总结,以便为其进一步研究提供参考。【关键词】脱氢酶：制备：纯化：活性检测：药物筛选doi：10.3969j.issn.1004-7484(x.2013.10.654文章编号：1004-7484(2013-10-6104-02生物体内的化学反应称为新陈代谢，简称代谢。生命的特征之一是不断地进行新

2、陈代谢，包括物质代谢和能量代谢。虽然生物体内的代谢条件十分温和，但所有代谢都进行得极为顺利和迅速，因为它们几乎都是在生物催化剂(biocatalyst的催化作用下进行的。迄今为止，人们已经发现了两类生物催化剂：酶与核酶。酶(enzyme是由活细胞合成的、具有催化作用的蛋白质。核酶(ribozyme是由活细胞合成的、具有催化作用的核酸。根据酶促反应的性质可将酶分为六大类：氧化还原酶类、转移酶类、水解酶类、裂解酶类、异构酶类和合成酶类。其中，氧化还原酶类是催化氧化还原反应的酶，又可分为氧化酶和脱氢酶两类。［1］脱氢酶类即需要辅酶I(NA+或辅酶II(

3、NAP+作为受氢体，催化底物氢化脱氢反应的酶。AH2+NA(P+A+NA(PH+H+脱氢酶(dehydrogenase是广泛存在于生物体内的一类代谢关键酶，在生物体内的氧化产能、解毒等生理活动中［1］起重要作用，是已知酶中种类最多的一类。如糖代谢过程中的3-磷酸甘油醛脱氢酶、乳酸脱氢酶(糖酵解途径［2］,丙酮酸脱氢酶、二氢硫辛酸脱氢酶、异柠檬酸脱氢酶、Q-酮戊二酸脱氢酶、琥珀酸脱氢酶、苹果酸脱氢酶(有氧氧化途径，6-磷酸葡萄糖脱氢酶(磷酸戊糖途径等；脂肪代谢过程中的3-磷酸甘油脱氢酶、脂酰CoA脱氢酶、B-轻脂酰CoA脱氢酶、B-務丁酸脱氢酶等；

4、氨基酸代谢过程中的L-谷氨酸脱氢酶以及酒精代谢过程中的乙醇脱氢酶、乙醛脱氢酶等。［1］目前，国内外不少学者对其进行了相关研究，本文将对其制备纯化、活性检测方法及在药物筛选中的应用进行介绍。1脱氢酶的制备纯化现在采用的纯化方法都是以脱氢酶与杂蛋白在理化性质和稳定性上的差别以及脱氢酶的生物学特性为依据。［3］①溶解度不同：有机溶剂沉淀法、盐析法、共沉淀法、选择性沉淀法、等电点沉淀法及双水相分离法。②根据酶和底物、辅助因子以及抑制剂间具有专一亲和作用特点的亲和分离法等。③根据电学性质、解离性质：吸附层析法、离子交换层析法、电泳法及聚焦层析法等。④根据分

5、子大小的差别：凝胶过滤层析法、超滤法及超离心法等。⑤按稳定性不同：酸碱变性、法热变性法、表面活性剂变性法等。通常先运用非特异、低分辨率的操作单元，如沉淀、超滤和吸附等,这一阶段的主要目的是尽快缩小样品体积，提高产物浓度，除去最主要的杂质；然后是高分辨率的操作单元，如具有高效选择性的离子交换色谱和亲和层析，而将凝胶过滤层析这类分离规模小、分离速度慢的单元放在最后。武爱民等［4］采用弱阴离子树脂EAE-52和蓝色琼脂糖凝胶FF层析对枯草芽胞杆菌产生的胞外二氢硫辛酰胺脱氢酶的粗酶液进行2步纯化，得到电泳纯的二氢硫辛酰胺脱氢酶,纯化倍数为59.7,收率为

6、46.9%o夏玉凤等［5］以玉米黄化苗为生物材料，将其捣碎后，通过差速离心获得线粒体，使用超声波将其破碎，用2%TritonX-100溶膜，超速离心，硫酸铁沉淀，EAE-C32层析纯化琥珀酸脱氢酶，纯化倍数为12倍。电泳图谱显示一条带。李洪山等［6］采用差速离心法、硫酸鞍分级沉淀，EAE纤维素和半琼脂糖柱层析方法，从早生植物梭梭体内分离出纯化104倍的苹果酸脱氢酶。龚韧等［7］以猪心肌为原料，采用组织破碎、二度硫酸鞍盐析、EAESepharoseF.F.离子交换层析、PhenylSepharose6F.F.疏水层析及SephadexG-75Fin

7、e凝胶过滤等方法进行分离纯化，苹果酸脱氢酶比酶活达1212.97Umg,纯化倍数达122.64倍，酶活力收率为53.64%。asayoshiT［8］等用含l%TritonX-100的缓冲液从F.saccharophilum的膜蛋白提取，先用阴离子交换柱EAE-SephroseCL-6B和阳离子交换柱C-SephroseCL-6B分离，再用SephacrylS-300凝胶过滤层析，得到了纯化倍数为277的纯葡萄糖3-脱氢酶，收率达到32%O6-磷酸葡萄糖酸脱氢酶（6-PGAase在自然界中分布很广，据文献报道，已从植物、哺乳动物肝脏等中纯化出6-P

8、GAase［9］o莫宏春等［10］将枯草芽胞杆菌通过超声破壁,（NH42S04分段盐析,EAE-SepharoseFF离子交换层析，Bl