细胞实验教案1

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1、细胞生物学实验教案实验一细胞核与线粒体的分级分离一、实验目的了解差速离心法分离细胞器的原理，以及练习使用差速离心法分离哺乳动物的细胞核与线粒体。二、实验原理细胞内不同结构的比重和大小都不相同，在同一离心场内的沉降速度也不相同,根据这一原理，常用不同转速的离心法，将细胞内各种组分分级分离出来。分离细胞器最常用的方法是将纟R织制成匀浆，在均匀的悬浮介质中用爰速离心法进行分离,其过程包括组织细胞匀浆、分级分离和分析三步，这种方法己成为研究亚细胞成分的化学组成、理化特性及其功能的主要手段。匀浆(Homogeniza

2、tion)低温条件下，将组织放在匀浆器中，加入等渗匀浆介质(即0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙)进行破碎细胞使之成为各种细胞器及其包含物的匀浆。分级分离(Fractionation)山低速到高速离心逐渐沉降。先用低速使较人的颗粒沉淀，再用较高的转速，将浮在上清液中的颗粒沉淀下來，从而使各种细胞结构，如细胞核、线粒体等得以分离。由于样品屮各种人小和密度不同的颗粒在离心开始时均匀分布在整个离心管屮，所以每级离心得到的第一次沈淀必然不是纯的最重的颗粒，须经反复悬浮和离心加以纯化。分析分级分离得到

3、的组分，可用细胞化学和生化方法进行形态和功能鉴定。三、细胞核的分离提取(―)操作步骤1.用颈椎脱位的方法处死小白鼠后，迅速剖开腹部取出肝脏，剪成小块(去除结缔组织)尽快置于盛有0.9%Nad的烧杯中，反复洗涤，尽量除去血污，用滤纸吸去表而的液体。2.将湿重约1g的肝组织放在小平IllL屮，用量筒量取8ml预冷的0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液，先加少量该溶液于平1111屮，尽量剪碎肝组织后，再全部加入。3.剪碎的肝纽织倒入匀浆管中，使匀浆器下端浸入盛冇冰块的器皿中，左手持Z,右手将匀浆

4、捣杆垂直插入管中，上下转动研辭3〜5次，用3层纱布过滤匀浆液于离心管中，然后制备-•张涂片①，做好标记，自然干燥。4.将装有滤液的离心管配平后，放入普通离心机，以2500rpm,离心15分钟；(1)缓缓取上清液，移入高速离心管中，保存于有冰块的烧杯中，待分离线粒体用：(2)同时涂一张上清液片②做好标记，自然十燥；(3)余下的沉淀物进行下一步骤。5.用6ml0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化钙溶液悬浮沉淀物,以2500rpm离心15分钟弃上清，将残留液体用吸管吹打成悬液，滴一滴于干净的载玻片上，

5、涂片③，自然干燥。6.将①、②、③涂片用I%甲苯胺兰染色后盖片即可观察。（二）结果分别于高倍镜下观察三张涂片，描述镜下所见。四、高速离心分离提取线粒体（一）操作步骤1.将装有上清液的高速离心管，从装有冰块的烧杯中取出，配平后，以17000rpm离心20分钟，弃上清，留取沉淀物。1.加入0.25mol/L蔗糖一0.003mol/L氯化鈣液Iml,用吸管吹打成悬液，以17000rpm离心20分钟，将上清吸入另一试管屮，留取沉淀物，加入0.1ml0.25mol/L蔗糖-0.003mol/L氯化钙溶液混匀成悬液（可

6、用牙签）。2.取上清液和沉淀物悬液，分别滴一滴于干净载玻片上（分别标记④、⑤涂片），各滴一滴0.02%詹纳斯绿B染液盖上盖片染20分钟。（二）结果汕镜下观察，颗粒状的线粒体被詹纳斯绿B染成蓝绿色。作业光镜或油镜下观察制备的细胞核与线粒体样本。实验二细胞膜的通透性观一、实验目的1.掌握细胞膜通透性的实验方法。2.观察并掌握相对分子量、脂溶性大小、电解质和非电解质对细胞膜通透性的影响。二、实验原理细胞膜在不断变化的环境屮必须保持自身的稳定状态才有生存。细胞膜允许一些物质通透，乂能降低甚至阻止另一些物质的通透，所

7、以细胞膜具有选择通透性。水是生物界最普遍的溶剂，水分子可以按照物质浓度梯度从渗透压低的一侧通过细胞膜向渗透压高的一侧扩散，这种现象就是渗透。将红细胞放在低渗盐溶液屮，水分子大量渗到细胞内，可使细胞胀破，血红蛋白释放到介质屮，由不透明的红细胞悬液变为红色透明的血红蛋白溶液，这种现象称为溶血。将红细胞放在某些等渗盐溶液屮，由于红细胞膜对各种溶质的通透性不同，膜两侧的渗透压平衡会发生改变，也会发生溶血现象。在不同相对分子量、脂溶性大小以及电解质和非电解质等各种溶液中，红细胞质膜对各种溶质的渗透性不同。rh于溶质透

8、入速度不同，溶血时间也不同。因此，发生溶血现象所需吋间长短可作为测量物质进入红细胞速度的一种指标。本实验通过观察红细胞溶血现象时间的不同来记录渗入速度，从而测量各种物质通透性的差别。三、实验用品1.实验材料血液（兔血或鸡血，含适量肝素）2.仪器50mL烧杯、10ml试管、试管架、移液枪及枪尖，标签纸、吸水纸等。3.主要试剂0.17mol/L氯化钠0.17mol/L氯化钱0.17mol/L醋酸钱0」7mol/L硝酸