western-blot试验步骤实验室专用文档

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1、WESTERN-BLOT操作步骤（一）蛋白样品制备（1）单层贴壁细胞总蛋白的提取：1、倒掉培养液，用吸管吸取培养基弃之，或将瓶倒扣在吸水纸上使吸水纸吸干培养液（或将瓶直立放置一会儿使残余培养液流到瓶底然后再用移液器将其吸走）。2、每瓶细胞加3ml4°C预冷的PBS（0.01MpH7.2〜7.3）。平放轻轻摇动lmin洗涤细胞，然后弃去洗液。共洗细胞三次以洗去培养液。将PBS弃净后把培养瓶置于冰上。4、每瓶细胞加200卩1含PMSF的裂解液（根据细胞数量），于冰上裂解30min,为使细胞充分裂解可

2、将培养瓶在振荡器上震荡，当变成粘液状态时可以停止裂解。5、裂解完后，用枪将细胞碎片和裂解液移至1・5ml离心管中。（整个操作尽量在冰上进行。）［于4°C下12000rpm离心5min。（提前开离心机预冷）,将离心后的上清分装转移倒0.5min的离心管中放于一20°C保存。（木实验室可以省略，因裂解液能将细胞充分裂解）］6、将离心管于95度干锅或100度沸水中加热10-15分钟，使蛋白充分变性。7、取出离心管放于冰上冷却，使热蒸汽冷却，离心机上离心使收集水分，以免影响蛋白浓度。8、将蛋白放于-20

3、。C保存。（2）组织中总蛋白的提取：1、将少量组织块置于1〜2ml匀浆器中球状部位，用干净的剪刀将组织块尽量剪碎。2、加400U1单去污剂裂解液裂（含PMSF）于匀浆器中，进行匀浆。然后置于冰上。3、儿分钟后再碾一会儿再置于冰上，要重复碾儿次使组织尽量碾碎。4、裂解30min后，即可用移液器将裂解液移至1.5ml离心管小，然后在4°C下12000rpm离心5min,取上清分装于0.5ml离心管中并置于-20°C保存。（3）加药物处理的贴壁细胞总蛋白的提取：由于受药物的影响，一些细胞脱落下来，所以

4、除按（一）操作外还应收集培养液屮的细胞。以下是培养液中细胞总蛋白的提取：1将培养液倒至15ml离心管中,于2500rpm离心5min<»2、弃上清，加入4mlPBS并用枪轻轻吹打洗涤，然后2500rpm离心5min。弃上清后用PBS電复洗涤一次。3、用枪洗干上清后，加100ul裂解液（含PMSF）冰上裂解30min,裂解过程中要经常弹一弹以使细胞充分裂解。4、将裂解液与培养瓶屮裂解液混在一起4°C、12000rpm离心5min,取匕清分装于0.5ml离心管中并1!于一20°C保存。（二）蛋白含量

5、的测定方法一：用蛋白浓度测量仪进行检测，用Q水做空白对照，分别检测各管蛋白的浓度，并做好记录。上样蛋白量除以蛋白浓度即为上样的蛋白量的体积。loddingbuffer按照1:4总体积比例混匀（5Xloding的量为总加样量除以5）。Q水的量为总加样量减去加样蛋口量减去loding的量。将三者混匀后煮沸5分钟使loding变性。（10孑L道加样孔的最大限度可加40ul样品。）方法二：1融化蛋白2稀释1:4,llul蛋白，44ul水，分别容在一EP管里,要换枪头。3每个蛋口两个孔，再加两个空白孔，每

6、孔加200ul的BCA工作液，按照A液：B液50:1的比例配置，4每个EP管加25ul的蛋白，每个蛋白加两管，空白孔加25ul的水，37度30分钟5酶标仪检测蛋白浓度6将数值带入Excel表，计算浓度值（三）SDS-PAGE电泳（1）清洗玻璃板:一只手扣紧玻璃板，另一只手蘸点洗衣粉轻轻擦洗。两面都擦洗过后用自来水冲,再用蒸憾水冲洗干净后立在筐里晾干。（2）灌胶与上样1、玻璃板对齐后放入夹中卡紧。然后垂直卡在架子上准备灌胶。（操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。）下胶（分离胶）2枚4%6%8%10%1

7、2%14%DDM水(ml)5.34.33.32.31.30.3Sol.1(ml)2.03.04.05.06.07.0Sol.27.5ml10%SDS150ulTEMED防护12ul25%APSlOOul上胶（浓缩胶）2枚DDM水Sol.1Sol.310%SDSTEMED25%APS2.65ml1.0ml3.75ml75ul6ul25ul2、按前血方法配10%分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。灌胶时，可用10ml枪吸取5ml胶沿玻璃放出，待胶面升到绿带中间线高度时即可。然后胶上加一层无水乙

8、醇，液封后的胶凝的更快且可以赶走气泡。（灌胶时开始可快一些，胶面快到所需高度吋要放慢速度。操作吋胶一定要沿玻璃板流下，这样胶中才不会有气泡。加无水酒精液封时耍很慢，否则胶会被冲变型。）3、当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝了。再等3min使胶充分凝固就可倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。4、按前面方法配4%的浓缩胶，加入TEMEI）后立即摇匀即可灌胶。将剩余空间灌满浓缩胶然后将梳了插入浓缩胶中。灌胶时也要使胶沿玻璃板流下以免胶中有气泡产生。插梳子时耍使梳子保持水平。由于胶凝固时体积会收缩减小，