细胞培养—传代—冻存—western-blot等实验相关步骤.doc

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1、围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结实验一：细胞传代培养材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10%FBS的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（SKOV-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10%FBS的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS2ml清洗2次（切勿用力吹打）

2、。3、用移液枪取trypsin1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长，以免损伤细胞）。4、往培养瓶中加入16401~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000r/min，5min。5、弃上清液，加入少量10%FBS的1640培养基使成细胞悬液。6、分装，按1:2~3传代，每瓶4~5ml。倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆形，细胞间隙等距），标记。7、放入CO2培养箱中培养，第二天观察生长状况。总结：1、在用离心机时，看清楚是RCF还是RPM；调节Temp.以及Time

3、。2、在用移液枪吸出trypsin充分消化后的细胞后，须知用少量培养液清洗一下培养瓶，并将清洗液移入离心管中。3、每取用一个容器，拧开或者拧上盖子时，注意在酒精灯上旋转一圈。另外，记住用酒精棉球经常擦拭台面。4、在用移液枪或者吸管混匀细胞悬液过程中，动作轻柔，避免产生气泡等。实验二：细胞冻存材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、冻存管、RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、FBS、PBS、trypsin、DMSO等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（OVCAR-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工

4、具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好，汇合度达到95%左右），弃旧培养基，PBS2ml清洗2次。3、用移液枪取trypsin1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2~3min。4、往培养瓶中加入16401~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000r/min，5min。5、取冻存管一个，往里面分别加入100ulDMSO（须避光保存）、200ulFBS、70

5、0ul1640，用移液枪轻轻吹打混匀。标记好细胞类型，时间等。6、弃上清液，加入冻存液使成细胞悬液。7、细胞悬液加入冻存管后，放在降温盒中，置于-80°C冰箱过夜，第二天再放入液氮罐中保存。总结：1、常用细胞保护剂有甘油和二甲基亚砜（DMSO），可使冰点降低，在缓慢解冻过程中，能够使细胞内水分在冻结前透出细胞外。2、细胞冻存和复苏应遵循缓慢降温、快速复苏的原则。细胞冻存中DMSO浓度一般为5%—15%，常用10%。冻存液中血清可促进细胞复苏后的存活率。2、细胞置于-80°C可保存半年左右，液氮长期保存。3、冻存细胞从-80°C低温冰箱中转移到液氮罐中，这个操作应该在2m

6、in内完成。（冻存管会以10°C/min的速度升温，若温度上升超过-50°C，细胞会迅速恶化）实验三：细胞复苏材料：15ml离心管、枪（头1ml）、无菌吸管、培养瓶、RPMI—1640(OVCAR-3)、FBS、PBS等步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（OVCAR-3）1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；FBS、RPMI—1640放在37°C水浴恒温箱中预热。2、快速（2min内）从低温冰箱中取出OVCAR-3细胞置于37°C水浴箱内解冻。3、往培养瓶中加入164010ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心100

7、0r/min，5min。4、弃上清液，加入新的培养基，用移液枪轻轻吹打混匀成悬液。5、按照1:2分装到培养瓶中，做好标记。6、置于CO2培养箱中培养观察。总结：1、细胞在-5°C—0°C最易受损，故复苏时应快速置于37°C水浴箱中（尽量2min内完成）。2、由于DMSO突然稀释会给细胞造成严重的渗透性伤害，稀释细胞存活率降低，复苏后应该缓慢稀释细胞悬液，3、冻存细胞从-80°C低温冰箱中转移到液氮罐中，这个操作应该在2min内完成。（冻存管会以10°C/min的速度升温，若温度上升超过-50°C，细胞会迅速恶化。）4、倘若细胞冻存状态不是