读书报告翻译

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1、标题：包含弗林蛋白酶裂解序列的重组蛋白e23sFv-TD-tBID对HER-2阳性肿瘤细胞的选择性毒性的研究背景：1.HER2，即人类表皮生长因子受体-22．HER2是一种膜表面结合酪氨酸激酶活性型受体。其涉及转导通路。该通路导致了细胞生长和分化。3.它由原癌基因HER2/neu编码.4.HER-2存在于乳腺癌上的抗原，是免疫疗法的靶点。5.EGF家族配体无法激活HER-26.然而HER-2和ErbB受体家族的其他成员由单体转化为二聚体聚合可以激活其活性。（EGFR属于ErbB受体家族的一种）简介：1.HER2/neu原癌基因编码了一个分子量在185kDa的跨膜糖蛋白，其属于生长因

2、子受体家族，并且它本身带有酪氨酸激酶活性。2.在25%到30%的原发性人类乳腺癌中都有HER2/neu的高表达，其也与预后差有关。3.因为它在喜欢在肿瘤细胞表达，所以它是理想的以抗体为导向的靶点。4.免疫毒素依靠其毒性的效能，通过特异性的配体锁定癌细胞达到杀死肿瘤细胞的作用。5.目前另一种重组免疫毒素已成功地用于临床试验。e23sFv-TD-tBID介绍1．基于先前构建的免疫毒素e23sFv-PEA40，我们开发出一组重组免疫促凋亡分子。其包括了抗-HER2单链可变区抗体片段(scFv)。2.BID属于促凋亡Bcl-2蛋白家族，主要在线粒体水平参与了细胞凋亡的调控3.Bid蛋白水解

3、形成其截短形式tBID。tBID是促凋亡活性的一个先决条件。tBID可以促进凋亡因子的释放。4.一个大小在10个残基的弗林蛋白酶裂解序列融合在抗体片段和tBID之间。图片：A代表：重组免疫促凋亡分子e23sFv-TD-tBID。N末端有HIS标签。B：表达重组蛋白的细菌SDS-PAGE分析。C:纯化后蛋白SDS-PAGE分析D：Westernblot分析。重组蛋白的活性鉴定：1.细胞ELISE：A.HER2阳性SKBR3细胞和HER2受体阴性的人脐静脉内皮细胞（内皮细胞）接种于96孔板。B.用含有6%牛血清白蛋白的PBS封闭后，加入纯化后的1μg/mLe23sFv-TDtBID孵育

4、90min。再用抗HIS单抗和辣根过氧化物酶抗鼠IgG孵育2次，每次1h。在使用3,3'，5,5'-四甲基联苯胺后，在450nm处测其吸收峰。C.通过检测线粒体膜电位损失评估促凋亡效果1.体内抗肿瘤活性：在雌性BALB/c裸鼠（4-6周龄）右侧乳腺细胞接种5×106人乳腺癌SK-BR-3脂肪。用不同的治疗因子处理细胞：e23sFv-TD-tBID（5mg/KG，在0,2,4,6,8天时处理），赫赛汀（10mg/kg,处理时间同上），紫杉类药物紫杉醇（15毫克/公斤，1-3天时处理），阿霉素（5mg/kg,1天），PBS作对照。每周测定小鼠体重和肿瘤的大小两到三次。结果：图2：A表示

5、，细胞酶联免疫吸附实验中e23sFv-TD-tBID对HER2阴性细胞HUVEC和HER2阳性细胞SK-BR-3的实验结果。B表示，各种HER2阳性的细胞，一种HER2阴性的细胞和重组抗体e23sFv-TD-tBID的特异性结合能力。C表示，当加入抗HER2单抗时，重组蛋白的特异结合能力，这个实验旨在说明附加物tBID并没有改变e23sFv的结合特异性。D表示，通过共聚焦显微镜观察到的SK-BR-3细胞中内化的重组免疫毒素（e23sFv-TD-tBID）。小图a表示，在4摄氏度下孵育的情况，小图b表示，在37摄氏度下孵育的情况。2.结果显示重组蛋白可以完全结合到所有5种HER2阳性

6、细胞。当加入HER2单抗后，这种互动可以被完全阻断，表面tBID并没有改变e23sFv的结合特异性。图3：A，流式细胞仪分析HER2的表达水平。B，共聚焦显微镜分析e23sFv-TD-tBID对人类乳腺癌肿瘤细胞结合实验结果。对照组用了同样带有HIS标签的蛋白作为对照。这个实验表明，his标签没有影响重组抗体的特异性。图4：A，5种肿瘤细胞用重组蛋白处理48小时的剂量反应曲线（可以先不说这组实验说明各种肿瘤细胞HER2表面表达量和其对重组抗体敏感性的关联性。）B，诱导细胞凋亡评估C，e23sFv-TD-tBID介导的细胞凋亡的特点是线粒体跨膜电位减少D,Baf：内涵体抑制物bafd

7、ec-RVKR-cmk：弗林蛋白酶抑制物BFA：蛋白质运输抑制剂bfa最后文章总结说：内化的重组蛋白在被弗林蛋白酶裂解后直接转运至细胞质。图5：A，三组小鼠在用重组蛋白处理后其肿瘤生长有明显的抑制，在5或10mg/kg时生长几乎停止了。B，在联合用其它药物治疗时，如阿霉素或紫杉醇，重组蛋白的抑制效果更好。C，表示了e23sFv-TD-tBID，赫赛汀，或化疗处理的小鼠的存活时间要长于未处理小鼠D，用e23sFv-TD-tBID，赫赛汀处理的小鼠的存活时间要长于用其它化