定量PCR实验数据处理

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1、定量PCR实验数据处理1.定量PCR的实验要素目标基因未知样品生成标准曲线标准品梯度监控系统故障阳性对照监控污染阴性对照校准生物学误差?管家基因(IPC)校准物理误差?参比荧光(ROX)降低其余误差重复实验96孔板设置举例样品标准品?目的：生成标准曲线，建立CT值与浓度之间的数学关系?不要求：?数学关系是抽象的，不要求标准品与目标基因使用相同的DNA?可以使用相同的DNA?也可以使用不同的：PCR产物、质粒、病毒、人工合成片段……?要求：?5点以上?浓度已知?PCR效率一致，且接近100%•仪器一致•反应条件一致：循环参数、同一次实

2、验•试剂质量一致：模板、引物和探针Tm值、酶及缓冲液梯度稀释方法选择目标、提取/PCR、纯化、测定浓度、调整浓度、梯度稀释CT值在18-30之间，覆盖全部样品浓度区间10倍连续梯度稀释方法：1v原液(标准品i)+9v稀释缓冲液，得标准品ii1v标准品ii+9v稀释缓冲液，得标准品iii1v标准品iii+9v稀释缓冲液，得标准品iv1v标准品iv+9v稀释缓冲液，得标准品v切不可由标准品I分别加不同体积的稀释缓冲液直接得到标准品ii、iii、iv、v标准品单位标准品的性质决定最终结果的性质：DNA标准品，已知拷贝数→绝对定量，得未知样

3、品拷贝数DNA标准品，已知ng/uL→绝对定量，得未知样品ng/uLDNA标准品，未知拷贝数或浓度，已知稀释倍数→相对定量，得未知样品之间相差倍数RNA标准品，已知ng/uL，与未知样品同样反转录，梯度稀释cDNA→相对定量，得未知样品ngRNA/uL?注意测定对单位的要求如果要求测定样品的基因拷贝数，→梯度稀释已知摩尔浓度的DNA片段如果要求测定样品的重量百分比[%(w/w)]，如转基因，标准品是将转基因与非转基因食品粉末按重量比混合，然后抽提混合DNA；切不可先抽好转基因DNA，再梯度稀释，也不可分别抽提转基因与非转基因DNA，

4、再按重量比例混合（这样得出的是基因重量百分比，而不是样品重量百分比）PCR效率对定量结果的影响测定PCR效率•标准品DNA与目标DNA必须是一样的吗？•当检测多个基因时，需要分别做标准曲线吗？做几条标准曲线？RelativeStandardCurveComparisonofthec-mycexpressionlevelinbrain,kidney,liverandlungStandard:RajiCelllinetotalRNAEndogenousControl:GAPDH管家基因—IPC?通常以uL或者ug为单位取样?细胞培养液：

5、同样体积，细胞数目并不同样?DNA溶液：抽提效率和操作误差，同样体积的DNA并不来源于同样数目的细胞?copy/uL要校正成copy/cell才有意义IPC的定义••什么是什么是IPCIPCIPC通常选用管家基因它与目标基因在相同的PCR条件下具有相似的扩增效率••IPCIPC的作用的作用监控PCR抑制物、DNA/RNA提取的损失、操作误差等对定量数据的影响，并对以上原因造成的定量误差进行修正。IPC的选择标准-在所有待测样品中，内对照(EndogenousControl)的表达量都恒定不变-注意所选基因是否是组织依赖的、发育阶段依

6、赖的、或者处理方式依赖的-多重定量时，内对照的表达量最好比目标基因高-推荐使用HumanEndogenousControlPlate(P/N4309920)测试不同管家基因的效果-常用的内对照有18SrRNA、β-actin、GAPDH等•在使用TaqManMGB探针的情况下，你认为管家基因与目标基因是在同一管内做多重定量好，还是分成两管分别定量好？哪一种检测的数据更精确？扩增效率要一致曲线斜率<0.1ROX以固定的浓度配在MasterMix中ROX不参与PCR扩增，信号强度只与Mix用量有关校准枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如

7、管盖厚度、透光性能不一致）所导致的光能损失、仪器稳定性（如孔间、批间温度的波动）的误差等减少孔间差异和批间差异，提高数据的重现性和精度ROX校准的效果重复样品?重复次数请遵循统计学的要求?小样本统计，n>6?未知样品和标准品都要重复?所有复管在同样条件下完成PCR•你为什么会想到做多重定量？•多重定量能达到目的吗？定量PCR的数据处理绝对定量与相对定量绝对定量与相对定量•绝对定量–优点：给出目标基因的绝对数量，数据容易处理–缺点：必须有标准品，做标准曲线，难以制备和质控相对定量–优点：可以不做标准品；标准品容易制备；使用广泛–缺点：

8、数据理解困难绝对定量：绝对标准曲线法目标：测定目标基因的准确拷贝数绝对定量误差的校正•生物学方面的误差：IPC校正细胞数量的差异、抽提效率、纯化损失、反转录效率等•物理方面的误差：ROX校正枪的误差（如试剂体积）、耗材质量（如管盖厚度