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1、人源性角蛋白的提取以及小分子HHK肽蛋白生物活性王宁1赵东旭2刁小娟3(北京理工大学生命科学与技术学院100081)【中图分类号】R758【文献标识码】A【文章编号】1672-5085(2010)19-0142-04【摘要】生物材料角蛋白(HHK)可诱导损伤组织细胞的再牛，引起细胞牛长分化状态的变化，是具有组织相容性的优良天然牛物材料。木研究通过化学法提取HHK,超声波处理HHK水溶液,制得小分子量肽蛋白,MALDI-TOF-MS检测HHK分子量范围，体外MTT检测研究HHK小分子肽蛋白对细胞增殖的影响，流式细胞术检测HKK对细胞周期的
2、影响。结果证明，分子量小于1500Da的HHK蛋白肽段对细胞增殖影响具有浓度依赖特性，对细胞增殖影响最大的HHK肽段浓度为10mg/mL,细胞周期受HHK添加浓度影响。说明HHK分子中蛋白序列具有特异的诱导调控细胞增殖分化的牛物活性。【关键词】生物医用材料角蛋白MTTMALDI-TOF-MS引言：诱导组织再牛牛物材料的诱导性能可能源于材料空间三维结构，材料分子结构中具有组织细胞特异识别片段，以及生物材料中含有核酸片段三个方面。人发角蛋白(Humanhairkeratin,HHK),是一种具有优良材料学性能，生物相容性，无免疫原性，可降解
3、的天然生物材料［1］,可经过机械法［2,3］,化学法［4］,牛物法⑸，提取。提取的角蛋白粉末通过添加交联剂戊二醛⑹，或采用模压方法等可以制成力学性能优良的生物医用材料，并可作为组织工程用细胞生长支架。角蛋白材料与其他组织植入材料相比，具有优良的诱导组织再牛能力，受损组织修复时间缩短，组织生理功能恢复良好。其中角蛋白制成的人工腱⑺已用于临床，取得了较理想的效果，用于修复脊髓损伤［8］,真皮缺损［9］,角蛋白纤维桥接周围神经缺损［10］等，均取得了预期良好的效果。Parry［ll］发现角蛋白的一级氨基酸序列由两种基木的五肽环重复单元构成，分
4、别为重复单元A(C-C-X-P-X)#B（C・C・X・S/T・S/T）,这里C代表半胱氨酸（Cys）,P代表脯氨酸（Pro）,S代表丝氨酸（Ser）,T代表苏氨酸（Thr）,X代表除这几种之外的构成蛋白质的任何一种氨基酸。在第--种重复单元A中又衍生出两种新的重复结构单元C-C-Q-P-X（Al）和C-C-R-P-X（A2）o这些重复单元相互作用构成重复单元组合。不同的提取方法会得到分子量不同的HKK片断，处理吋间越长，处理条件越苛刻，所得HKK分子量越小，溶解率越高。本研究通过化学法提取HKK,超声波处理HKK水溶液，得到分子量小于1
5、500Da的肽蛋白，通过体外MTT检测细胞增殖情况，流式细胞术检测细胞周期变化，初步验证小分子肽蛋白对细胞增殖分化的影响。结果证明小分子肽蛋白对实验用三种细胞增殖能力，细胞周期均有影响，证明了组织诱导性生物材料分子组成可调控细胞生长分化。1实验仪器和材料1.1实验仪器：RayToRT-600酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）；FiveEasy实验室pH计（梅特勒托利多）；电子天平PL203（梅特勒托利多）；冷冻干燥机（LGJ-18C）；TGL-16B高速台式离心机4800PlusMALDITOF/TOFTM美国ABI公司，贝克曼
6、EPICSXL-MCLADC流式细胞仪，细胞周期拟和软件ModFit。XS乙D2倒置光学显微镜（重庆光学仪器厂）；JY92-IIN超声波细胞破碎机（宁波新艺超声设备有限公司）；超净台（北京文慧天创洁净有限公司）。1.2实验材料及试剂：人发粉末（人发理发店随机取样），Hela细胞，Shg-44神经胶质瘤细胞，3T3成纤维细胞由实验室提供。β■疏基乙醇（AR北京化学试剂厂）；十二烷基磺酸钠（SDS）（AR北京化学试剂厂）；尿素（AR北京化学试剂厂）;»蓝（MTT）购自Sigma公司；漠化乙锭（PI）购自Sigma公司；RNaseA
7、Ml自Sigma公司；TritonX-100（AR北京化学试剂厂）。2实验方法2.1水溶性角蛋白提取参考文献所述方法[12],β-^基乙醇用三蒸水稀释至3%,加入尿素，使得尿素浓度达到7mol/L,加入SDS,使W（SDS）=2%,配置成还原性溶液。人发粉末称重H,以X100浸泡于还原溶液中，45°C反应12h。反应完成后，室温冷却，离心取上清。上清收集，倒入截流分子量为12-24Kb的透析袋中，透析36小吋。所得角蛋白溶液冷冻干燥24小吋后得絮状白色角蛋白粉末。所得角蛋白粉末按溶于纯水中分别配制成O.lg/ml,0.01g/
8、ml,0.001g/ml,O.lmg/ml角蛋白溶液，冰浴条件下超声波处理5分钟，功率600w,超声7s,间歇8s,得到透明澄清角蛋白溶液，・20°C冻存后置于4°C保存过夜，得到结晶（图一）。2.2MAL
