血清小分子肽的分离和生物活性检测.pdf

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1、分类号Q2§圣学校代码!Q§垒2密级血清小分子肽的分离和生物活性检测Isolationandbioactivitytestofserum．．derivedsmallpeptides指导教师姓名、职称鋈堡垒整撞湖南师范大学学位评定委员会办公室二零一一年四月背景和目的：摘要㈨UlIIFillIIIIIIIFPIllI{Y19191血清包含许多种肽，其中一些具有生物活性，在生理调节过程中起重要作用。由于相对分子质量lk,--3kDa区间的血清肽含量极低，分离纯化困难，因此对其组分及其功能所知甚少。本研究旨在检测血清lk---3kDa超滤组分的

2、生物活性，分离和纯化其中的小分子肽，为阐明血清肽组成分及其生理意义提供实验证据。方法：将血清作串联超滤，截取lk,--3kDa的浓缩组分。进行小鼠骨髓成纤维细胞集落形成单位(CFU．F)及粒系．巨噬系造血组细胞(CFU．GM)集落生成实验、小鼠成纤维细胞株(3T3)和人脐静脉内皮细胞株(孙7EVC)细胞培养，采用集落计数、细胞计数、MTT比色法和流式细胞技术，检测血清1k-一3kDa超滤组分对细胞生长和活力的影响。进行血清lk,-,3kDa超滤组分的C18反相高效液相色谱(C18RP．HPLC)分离，然后对分离的纯化肽进行质谱分析，并用

3、所获质谱数据作蛋白质／肽信息库搜索鉴定。结果：(1)CFU．GM集落形成实验显示，5％血清lk～3kDa超滤组分体积分数组的集落产率显著高于对照组，10％体积分数组的集落产率与对照组之间的差异无显著性，15％、20％、30％超滤组分体积分数组的集落产率反而显著低于对照组。(2)CFU．F集落形成实验显示，与对照组比，10％、15％、20％、30％体积分数组的集落产率显著减低；而集落之间的骨髓基质细胞显著增多。(3)骨髓基质细胞在血清lk～3kDa超滤组分体积分数为20％的条件下培养48h后，Gl期细胞的百分率降低，S期细胞的百分率增古同

4、o(4)在血清lk～3kDa超滤组分体积分数为50／o,．-30％的3T3细胞培养体系，10％，15％，20％，30％体积分数组3T3细胞计数明显低于对照组；各体积分数组的MTT吸光值也显著低于对照组。在血清1,--3kDa超滤组分体积分数为20％的条件下培养48h后，3T3细胞的S期百分率降低，G2／M期百分率增加。(5)在50／旷30％体积分数范围内，血清lk～3kDa超滤组分对HUEVC细胞生长和活力无明显影响。(6)血清1k～3kDa超滤组分的C18RP．HPLC图谱上有20多个215nm波长吸收峰，一级质谱检测发现27min洗

5、脱峰为高纯度1793Da肽，30．5min洗脱峰为2062Da高纯度肽，这两种肽的二级质谱数据在蛋白质／肽库中未检索到对应信息。结论：血清lk～3kDa超滤组分含有多种小分子肽，在体外培养条件下，这些血清成分对不同细胞具有选择性的促进或抑制增殖的作用，并有一定的量效关系。相对分子质量分别为1793Da和2062Da的血清肽可能是两种新发现的肽。本研究的结果将为血清肽组成分及其功能的深入研究提供有价值的参考。关键词：血清；小分子肽：分离；生物活性ITABSTRACTBackgroundandpurpose：Serumcontainsala

6、rgenumberofsmallpeptides，someofwhichhavebeenshowntobebioactiveandplaytheimportantrolesintheregulationofphysiologicalprocesses．Owingtotheverylowabundanceandthedifficultiesofisolationandpurificationof1k-一3kDapeptidesinserum，littlehasbeenknownaboutoftheircharactersandfuncti

7、ons．Thisstudyaimedtoexaminethebioactiviesoflk-。3kDaserum．ultrafiltratedcomponentsandisolatelowmolecularweightpeptidesfromthem，offeringtheusefulinformationsfortheextensiveresearchontheprofileandfunctionofserumpeptidomeconstituents．Methods：Thelk^,3kDaserum—ultrafiltratedco

8、mponents(1k-一3kDasue)wereobtainedbytandemultrafiltration．Theassaysofgranulocyte．macrophagecolonyformati