免疫组织化学

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1、免疫组织化学掌握内容免疫组化的基本原理免疫组化的基本过程免疫组化的染色技术分类常用的免疫组化的染色原理和方法注意事项免疫组织化学的基本概念Immunohistochemistry又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用免疫学原理（特异的抗原抗体反应）来对组织内抗原（或抗体）的分布进行原位检测技术。1．发展简史1941年Coons首先用荧光素标记抗体—检测肺组织内的肺炎双球菌获得成功60年代Nakane建立酶标抗体技术70年代Stemberger改良上述技术，建立过氧化物酶—抗过氧化物酶（PAP）技术，使免疫细胞化学得到广泛应用。80年代Hsu等建立了抗生物素的（ABC）法之后，

2、免疫金—银染色法、半抗原标记法、免疫电镜技术相继问世。90年代分子杂交技术、原位杂交技术、免疫细胞化学分类方法迅速发展2000年各种免疫组化技术更加成熟，使免疫组化技术成为当今生物医学中形态、功能代谢综合研究的一项有力工具。免疫组织化学的优点1、特异性强——免疫组化从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示2、敏感性高——抗体稀释到几千分之一、上万分之一，甚至几亿分之一时仍可在组织细胞中与抗原结合3、定位准确，形态与功能相结合4.方法步骤统一——若掌握一种技术操作方法步骤，则一通百通。免疫组织化学的基本原理应用免疫学抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂

3、(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的研究基本过程抗原提取制备抗体抗体标记制备样品免疫前样品处理免疫反应显色反应观察分析一、提取抗原（antigen，Ag）生物化学各种方法提取抗原一类能刺激机体免疫系统使之产生特异性免疫应答，并能与相应免疫应答产物(抗体或抗原受体)在体内外发生特异性结合的物质。基本特性：一是诱导免疫应答的能力，也就是免疫原性，二是与免疫应答的产物发生反应，也就是反应原性抗原（antigen，Ag）表位，抗原结合位点，抗原决定簇（epitope）Ag1234表位A表位B表位C抗原克隆A克隆B克隆C多克隆抗体单克隆抗体抗体

4、蛋白分为V区和C区，V区高度可变，是识别抗原的区域，C区是很保守的二、制备抗体即多克隆抗体（PcAb）单克隆抗体（McAb）和基因工程抗体整体水平抗体生成技术细胞工程抗体生成技术基因工程抗体生成技术多克隆抗体（抗血清）单克隆抗体嵌合抗体、改形抗体“小型化抗体”（单链抗体）组合抗体库技术噬菌体抗体库技术Ig基因转基因小鼠抗体真核表达技术抗体的制备和选择原则：种属差异越大越好抗体的储存新制备或购进的是原液或冻干品，抗血清为全血清，单克隆抗体是培养上清液或腹水。1、4℃保存（6个月）2、低温保存（-70℃～-20℃，5年）3、真空干燥保存（5～10年）4、稀释的抗体不能长时间保存，在4℃

5、可存放1~3天，超过7天效价显著降低。抗体的储存注意：1、保存前需经除菌2、保存液含防腐剂（浓度低时，应加0.1%-1.5%的牛血清白蛋白作保护剂；必要时需要加0.01-0.15％NaN3防腐剂以延长保存时间；酶标记抗体不能用NaN3，会抑制酶的活性）3、避免反复冻融，分装（10ul或100ul/支）抗体稀释的配制：常用0.01mol/LpH7.4PBS或TBS缓冲液作抗体稀释液。抗体的最佳稀度倍数：由于各种抗体的效价不同，组织中抗原强弱不一，应根据不同情况作适当的调整，以取得中等阳性稀释度为佳，因其既适合于抗原性强和含量多的标本，也可用于抗原性弱的标本。三、抗体的标记物荧光素——

6、异硫氰酸荧光素（FITC）、异硫氰酸罗达明(TRITC);德克萨斯红；藻红素等酶——碱性磷酸酶、辣根过氧化物酶、葡萄糖氧化酶、半乳糖苷酶等金属：胶体金、胶体铁、铁蛋白等亲和素、生物素、放射性同位素等四、样品的制备组织材料处理是获得良好免疫细胞组织化学分析的保障，必须保证要检测的细胞或组织取材新鲜、固定即使及时、形态保存良好、抗原物质的抗原性不被破坏。标本的主要来源：活体组织、各种体液、穿刺液、培养细胞标本的固定与保存好的固定剂除能满足一般组织学固定目的外，还需要：（1）能快速固定抗原（2）防止抗原物质扩散（3）固定后的抗原能被抗体识别，不影响抗原抗体反应常用：10%福尔马林（酸性）

7、、乙醇、丙酮、甲醛、中性缓冲多聚甲醛、戊二醛混合固定液：Bouin液，Zamboni液、过碘酸-赖氨酸-多聚甲醛（PLP）固定液固定方法细胞表面抗原——新鲜冰冻切片，后固定于丙酮单层细胞、病毒、细菌——冷丙酮、冷乙醇细胞悬液——先固定，然后离心制成标本可溶性抗原——甲醛蒸气一般组织——新鲜取材、浸泡固定切片方法冰冻切片石蜡切片：乙醇脱水时间要短；浸蜡要快，温度低于60℃；玻片上要用黏附剂蜡块尽快切片，密封保存在4℃；染色前彻底脱蜡一般为5μm盖玻片、载玻片清洗干净，载