免疫组织化学技术.ppt

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1、免疫组织化学技术免疫组织化学（Immunohistochemistry）又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，它是用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测的技术。基本原理抗原抗体反应，即抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂(荧光素、酶、金属离子、同位素)显色来确定组织细胞内抗原(多肽和蛋白质)，对其进行定位、定性及定量的研究。免疫组化的特点特异性强敏感性高定位准确、形态与功能相结合免疫组化的作用凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等等均可用免疫

2、组织化学方法显示。实验所用标本石蜡切片是制作组织标本最常用、最基本的方法，对于组织形态保存好，且能作连续切片，有利于各种染色对照观察；还能长期存档，供回顾性研究。实验设备恒温冰冻切片机、脱水机、石蜡包埋机、切片机、摊片机、烤片机、冰箱、电磁炉、高压锅、染色架以及离心机和免疫组化试剂等脱水机、石蜡包埋机免疫组化技术分类1、免疫荧光方法2、免疫酶标方法3、免疫胶体金技术4、免疫铁蛋白法5、放射免疫自显影法酶联免疫组织化学ABC法S-P法免疫组化操作步骤一.石蜡切片制作1、固定：取组织，用PBS冲洗，放入4%多聚甲醛磷酸盐缓冲液内固定12h2、脱水：倒

3、去固定液，用蒸馏水冲洗3次，再用50%酒精冲洗2次，用酒精逐级脱水，70%酒精1天，80%酒精过夜，95%酒精3h，无水酒精（Ⅰ）、（Ⅱ）各2h3、透明：1:1无水酒精二甲苯45min，二甲苯（Ⅰ）、（Ⅱ）各30min4、包埋：（恒温箱内进行）浸入石蜡，1:1二甲苯石蜡（58℃）45min，石蜡（Ⅰ）、（Ⅱ）、（Ⅲ）共2.5h，用石蜡（Ⅲ）包埋组织5、切片：包埋后的组织块经修整后，用切片机切成5-7μm，的石蜡带6、贴片：将组织石蜡块在50℃温水中展片，然后用处理干净的载玻片捞片，组织带可黏在载玻片上（洗片：1%HCl浸泡过夜、蒸馏水冲洗、95%

4、酒精浸泡2h后擦干→涂胶：防脱剂多聚赖氨酸）7、烤片：68℃恒温箱内烤片2h二.SP（链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结）三步法染色步骤1、脱蜡、水化60℃×20分钟→二甲苯2×10分钟100%的绝对乙醇:2×5分钟;95%ethanol2minutes；95%的乙醇2分钟80%ethanol2minutes；70%ethanol2minutes；distilledwater:5min；蒸馏水:5分钟PBS洗3次×3min。2、阻断：3%H2O2去离子水（或80%甲醇）孵育10min，以灭活内源性过氧化物酶活性3、PBS冲洗2-3次，每次5min

5、4、抗原修复：置0.01M枸橼酸缓冲液（PH6.0）中用煮沸（95℃，15-20min），自然冷却20min以上，再用冷水冲洗缸子，加快冷却至室温5、PBS冲洗2-3次，每次5min6、封闭：滴加正常山羊血清封闭液，室温孵育20min，甩去多余液体7、滴加Ⅰ抗50μl，室温静置1h，或者37℃1h，或者4℃过夜（需在37℃复温45min）8、PBS冲洗2-3次，每次5min9、滴加辣根过氧化物酶标记的Ⅱ抗40～50μl，室温静置1h，或37℃1h10、PBS冲洗2-3次，每次5min11、滴加SP（链霉亲和素-过氧化物酶），室温或37℃孵育30m

6、in-1h12、PBS冲洗2-3次，每次5min13、显色：DAB显色5-10min，在显微镜下掌握染色程度（胞浆呈棕色者判定为阳性细胞）（显色剂的配置：在1ml水中加1滴显色剂A，摇匀，然后加1滴显色剂B，摇匀，再加1滴显色剂C，摇匀）（A：DABB：H2O2C：磷酸缓冲液）14、自来水冲洗10分钟终止反应15、复染：苏木精复染2min，盐酸酒精分化16、自来水冲洗10-15min17、常规脱水50%ethanol1-2min，70%ethanol1-2min95%ethanol1-2min；95%ethanol1-2min；100%absol

7、uteethanol:(1-2)min。透明：Xylene1×(1-2)min→Xylene2×(1-2)min封片（用中性树胶滴在组织旁边，再用盖玻片盖上）、镜检三.二步法免疫组化染色步骤二甲苯脱蜡，梯度酒精置换二甲苯PBS冲洗3次，每次3分钟根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复0.3%过氧化氢甲醇液阻断20分钟，以消除内源性过氧化物酶的活性PBS冲洗、浸泡5分钟，3次正常山羊血清室温封闭10分钟甩去血清，加入适当稀释的一抗，37℃孵育60分钟或4℃过夜PBS冲洗，浸泡5分钟，3次滴加多聚螯合物，37℃孵育30分钟PBS冲洗，浸泡5分

8、钟，3次新鲜配置酶底物显色液DAB显色3－10分钟流水冲洗苏木素复染，脱水，透明，封片。显微镜观察拍照IPP软件分析光密度几种抗原修复方