免疫组织化学常用技术方法大全（91页).ppt

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1、免疫组织化学常用方法大全第一节免疫酶细胞化学免疫酶细胞化学是免疫组织化学中最常用的方法，它是在抗原抗体特异反应存在的前提条件下，借助于酶细胞化学手段，检测某种物质（抗原／抗体）在组织细胞内的存在部位。即预先将抗体与酶连结（酶标抗体），再使其与组织内特异性抗原反应，经细胞化学染色后，在光镜或电镜下观察分析。一、常用酶的种类用于标记的酶应具备以下几点：●酶催化的的底物必须是特异性的，且容易被显示，所形成的产物易于在光镜或电镜下观察。●所形成的终产物沉淀必须稳定，不向周围组织弥散。●较易获得酶分子，最好有商品出售。●中性pH

2、时，酶应稳定，酶标记抗体后，保存1～2年活性不应改变。●酶标过程中，酶与抗体连结，不能影响二者的活性。●被检测组织中，不应存在与标记酶相同的内源性酶或类似物质。免疫组织化学常用酶———————————————————名称分子量内源性商品———————————————————HRP(POD)40-50kD+有ALP(AP)80-120kD++有———————————————————●HRP/POD（辣根过氧化物酶）显色原理：HRP+H2O2HRP·H2O2+供氢体（电子供体）HRP+H2O+供氢体（氧化型）DAB（二氢基

3、联苯胺）棕褐色AEC（3-氢-9-乙基咔唑）红色TMB（四甲基联苯氨）深蓝色●ALP/AP（碱性磷酸酶）底物：萘酚（As-Mx）发色团：FastBlueFastRedBCIP/NBT血细胞、淋巴细胞内源性过氧化酶含量较高可选用ALP/AP二、染色步骤及原理间接法：1.石蜡切片经二甲苯脱蜡，下行酒精至水;2.未固定的冰冻切片，丙酮固定20～30min，风干15～30min;3.用0.03%H2O2处理切片15～30min(室温)，封闭内源性过氧化酶的活性；4.PBS洗涤2min;5.0.05%Tween-20/PBS，

4、5min（室温）；(微波修复抗原、蛋白酶消化)6.0.1%-1%BSA湿盒内孵育15～25min（室温），然后轻轻弃去孵育液（不冲洗）；(或二抗动物的正常血清);7.轻轻弃去孵育液，滴加PBS稀释的第一抗体，湿盒内孵育1～2h（20-25℃）；8.PBS充分冲洗，5min×3次，以去除切片上非特异性吸附的抗体；9.滴加PBS稀释的HRP标记的第二抗体，湿盒内孵育45～60min（室温）；10.PBS漂洗5min×3次；11.显色，0.01%-0.1%H2O2／0.01%-0.05%DAB,10～15min；12.细胞核

5、复染（甲基绿或苏木素）；13.封片、观察、记录。亲和组织化学（affinityhistochemistry）植物凝集素与糖类生物素与抗生物素葡萄球菌A蛋白与IgG阳离子与阴离子激素、维生素、糖类与受体第二节抗生物素-生物素免疫细胞化学染色法一、基本原理抗生物素（卵白素）avidin分子量68000糖蛋白生物素（维生素H）biotin分子量244biotinavidinbiotinbiotinbiotin二、抗生物素-生物素-过氧化酶复合物技术(Avidin-Biotin-peroxidaseComplextechniq

6、ue,ABC法)其特点是利用抗生物素分别连接生物素标记的第二抗体和生物素标记的酶。secondantibody-biotin+Avidin+biotin-HRPABCcomplex操作步骤：1.石蜡切片脱蜡，系列酒精至水；2.冰冻切片丙酮固定10min，PBS洗涤5min×3；2.第一抗体，室温孵育60min；3.PBS洗涤5min×3次4.生物素标记的第二抗体，孵育45min5.PBS洗涤5min×3次6.ABC复合物，45min7.PBS洗涤5min×3次显色（H2O2/DAB）、复染、封片观察、记录seconda

7、ntibody-biotin+Avidin+biotin-HRPABC复合物的配制：biotin：avidin1：4avidin10μg/mlbiotin2.5μg/ml临用前30分钟配制ABC法特点：■敏感性强，具有放大作用■特异性强，背景染色淡■方法简便，节约时间■由于生物素与抗生物素具有与多种示踪物结合的能力，可用于双重或多重染色注意事项●内源性生物素活性及其消除：肝、肾、白细胞、乳腺预先以0.01%抗生物素和0.01%生物素溶液分别作用20min，以消除内源性生物素。●试剂的差异，应进行预实验。●ABC试剂盒保

8、存以4℃为佳。第三节葡萄球菌蛋白A（SPA）葡萄球菌蛋白A（staphylococalprotein,SPA）是一种从金黄色葡萄球菌细胞壁分离的蛋白质。早在1940年，Vevwey发现某些金黄色葡萄球菌中，含有一种物质，在双向扩散试验中能与正常人血清形成沉淀，1959年将其命名为A抗原。一、免疫学特性SPA具有与人及多种动物（豚鼠