色谱法原理及应用

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1、色谱法原理及应用2021/8/41Cap.1色谱的发展故事1900茨维特1931库恩1938马丁辛格1952马丁詹姆斯1960科克兰2021/8/42色谱的起源色谱法起源于20世纪初，1900年俄国植物学家米哈伊尔•茨维特用碳酸钙填充竖立的玻璃管，以石油醚洗脱植物色素的提取液，经过一段时间洗脱之后，植物色素在碳酸钙柱中实现分离，由一条色带分散为数条平行的色带。该实验将混合的植物色素分离为不同的色带，因此茨维特将这种方法命名为Хроматография，译为色谱。MikhailTsvet1872.0

2、5-1919.262021/8/43植物色素分离1931年德国柏林威廉皇帝研究所的库恩将茨维特的方法应用于叶绿素和叶黄素的研究，使用氧化铝作为固定相，奠定吸附色谱的基础。现今，以石油醚-丙酮作为洗脱剂，使用薄层层析板（正相硅胶-铝薄板）对植物色素进行分离，如右图。薄层层析新叶黄素叶黄素叶绿素B叶绿素A脱镁叶绿素2021/8/44色谱分析法普及1938年阿切尔·约翰·波特·马丁和理查德·劳伦斯·米林顿·辛格分离不同种类的氨基酸，他们将氨基酸水溶液吸附在固相的硅胶上，以氯仿冲洗，成功地分离了氨基酸。硅

3、胶Silicagel氯仿Chloroform2021/8/45诺贝尔化学奖（1952）RichardLaurenceMillingtonSyngeArcherJohnPorterMartin2021/8/46气相色谱出现1952年马丁和詹姆斯提出用气体作为流动相进行色谱分离的想法，他们用硅藻土吸附的硅酮油作为固定相，用氮气作为流动相分离了若干种小分子量挥发性有机酸。色谱技术和理论的发展：色谱技术标准化、自动化检测器的开发塔板理论和VanDeemter方程保留时间、峰宽、分辨率等概念2021/8/4

4、7高效液相色谱问世20世纪60年代末，科克兰（JosephJackKirkland）等人开发世界上第一台高效液相色谱仪，开启了高效液相色谱的时代。高效液相色谱使用粒径更细的固定相填充色谱柱，提高色谱柱的塔板数，以高压驱动流动相，使得经典液相色谱需要数日乃至数月完成的分离工作得以在几个小时甚至几十分钟内完成。《液相色谱现代实践》2021/8/48Cap.2色谱法的原理及分类2021/8/49什么是色谱法色谱法（Eng：Chromatography，又称层析）是一种分离和分析方法，在分析化学、有机化学

5、、生物化学等领域有着非常广泛的应用。色谱法利用不同物质在不同相态的选择性分配，以流动相对固定相中的混合物进行洗脱，混合物中不同的物质会以不同的速度沿固定相移动，最终达到分离的效果。三级学科---色谱学关键词---流动相、固定相、吸附、洗脱、分离。2021/8/410色谱法分离原理2021/8/411亲和色谱法利用生物大分子和固定相表面存在的某种特异性亲和力，进行选择性分离。主要用来从细胞提取物中分离纯化核酸、蛋白等。Step1：建立平衡Step2：进样、洗涤Step3：洗脱凝胶过滤层析也叫做分子排

6、阻层析SEC，一种利用带孔凝胶珠作基质，按照分子大小分离蛋白质或其它分子混合物的层析技术。一般是大分子先流出来，小分子后流出来。色谱法分类（按色谱介质分）2021/8/412柱色谱法（Columnchromatography）纸色谱法（Paperchromatography）薄层层析（Thinlayerchromatography）色谱法分类（按流动相物理状态分）2021/8/413气相色谱（GC）高效液相色谱（HPLC）亲和色谱（Affinitychromatography）Cap.3相关名词解

7、释2021/8/414色谱图（一）2021/8/415进样空气峰基线半峰宽死时间校正保留时间保留时间时间(min)峰高h信号(mV)色谱图（二）2021/8/416色谱图基线噪音色谱峰漂移拖尾分辨率问题分析2021/8/417噪音漂移积分线未分离峰面积计算2021/8/418分辨率计算2021/8/419分辨率区别2021/8/420R<1R>1.5固定相StationaryPhase2021/8/421流动相StationaryPhase2021/8/422固定相/流动相如何作用2021/8/4

8、23Cap.4HPLC-12602021/8/424问题一：HPLC是什么？2021/8/425A1.HighPerformanceLiquidChromatography高效液相色谱问题二：HPLC的特征？2021/8/426经典LCHPLC管柱内径1-5cm0.4cm管柱长度50-100cm15-50cm填料粒径150μm-200μm4μm-10μm操作压力1-10atm50-200atm分离时间0.5h-day10-30minA2.经典LC与HPLC比较问题二：HPLC的特征