抗真菌药物敏感试验

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1、抗真菌药物敏感试验沈永年概述真菌感染的发病率,尤其是深部真菌感染的发病率逐渐增高大量新型抗真菌药物不断涌现临床耐药菌株的出现抗真菌药物敏感实验为临床耐药菌株的发现，抗真菌药物的选择提供指导。概述抗真菌药物敏感实验方法是建立在抗细菌药物敏感实验方法基础之上由于真菌是一种高等的生物，其繁殖方式、生长周期、生长条件等均与细菌不同，因此抗真菌药物敏感试验一直是国内外学者研究的难题。因此，实验方法多样化，但尚无通用的标准方法。美国国家临床试验标准委员会（NCCLS）从1992年起，制订了一系列针对抗真菌药物敏感实验的指导性文件，但目前仍不能适用于所有医学真菌的检测。抗真菌药敏试

2、验目的指导抗真菌药物的选择测定抗真菌药物对致病真菌的敏感性，提供临床用药量及预后监测的参考筛选耐药菌株及研制对致病真菌有效的抗真菌药物提供临床应用常见术语最低抑菌浓度（minimalinhibitoryconcentration，MIC）MIC50，MIC90，MIC50％～80％最低杀菌浓度（minimalfungicidalconcentrationMFC）MFC50，MFC90最低有效浓度（minimaleffectiveconcentration，MEC）抗真菌药敏试验方法药基法琼脂稀释法试管（液体）稀释法微量液体稀释法菌基法（琼脂扩散法）ROSCO抗真菌药敏

3、纸片法E试验法（E－test）酵母样真菌药物敏感试验酵母菌液基稀释法抗真菌药物敏感试验于1992年由美国国家临床试验标准化委员会（NCCLS）提出标准实验方案（M27－P）以来，几经修订，目前已由M27－A2取代。此外，其他药物敏感试验方法如琼脂稀释法，琼脂扩散法，E试验法等时有应用。试管液基稀释法(NCCLS-M27A)药液的制备储存液：浓度至少为1280μg/mL或10倍于受试的最高浓度。储存液浓度需根据药物本身溶解性决定。氟康唑和5－氟胞嘧啶（5－FC）以灭菌蒸馏水溶解；酮康唑、伊曲康唑、两性霉素B、伏力康唑等采用DMSO溶解。储存液分装后置－60℃保存。解冻后

4、的储存液应在24h内使用，不得重复冻存使用。试管液基稀释法(NCCLS-M27A)药液的制备使用液：水溶性药物以无菌蒸馏水将储存液倍比稀释至工作液浓度（10倍测试浓度）。非水溶性药物则需将储存液用DMSO倍比稀释至100倍测试浓度，再采用无菌蒸馏水稀释至工作液浓度（10倍测试浓度），以防止药物的析出。试管液基稀释法(NCCLS-M27A)培养基的制备2倍浓度RPMI1640培养基（不含NaHCO3）作为标准培养基，用0.33mol/LMOPS缓冲液溶解,调节pH值至6.9~7.1（室温），过滤除菌，4℃可保存4周。在培养基中加入4%葡萄糖可促进菌生长，帮助终点的判断。

5、试管液基稀释法(NCCLS-M27A)菌液的制备受试菌在SDA或PDA中35℃培养24小时（念珠菌属）或48小时（新生隐球菌）。取直径约5mm菌落，混悬于5mL灭菌的生理盐水中，涡旋混匀15秒，采用分光光度计在530nm处，调整菌悬液至0.5个麦氏单位浊度，相当于1×106～5×106/mL，作为菌液的贮备液。使用时，采用2倍量培养基将菌液调整至工作浓度为1.0×103～5.0×103/mL。再用无菌蒸馏水倍比稀释成0.5×103～2.5×103/mL。试管液基稀释法(NCCLS-M27A)实验步骤：取无菌的15mm×100mm试管进行实验在试管中依次加入0.1mL倍

6、比稀释的不同浓度药物工作液。依次在试管中加入0.9mL菌工作液，混匀。注意整个过程需在15min内完成。实验过程中，设置空白对照和生长对照。同时进行质控菌株平行试验，进行质量控制。将试管置于35℃培养46～50h观察结果。对于新生隐球菌，培养时间应延长至70～74h。试管液基稀释法(NCCLS-M27A)结果判读两性霉素B终点的判断比较容易，无肉眼可见生长的最低药物浓度为两性霉素B的MIC值。氟胞嘧啶及唑类往往在最低浓度时也可出现轻度浑浊。此时，可取生长对照管中菌悬液0.2mL，加入培养基0.8mL混匀作为判断终点的浊度（即80％菌的生长受到抑制时的浊度)，与此浊度相

7、近的试管即可判定为终点，其药物浓度为该药的MIC值。试管液基稀释法(NCCLS-M27A)结果的判定新三唑类药物酵母菌的MIC值为0.03~16μg/mL，大多数酵母菌的MIC值小于1μg/mL。目前尚无资料说明MIC值与临床疗效之间的关系。氟胞嘧啶、氟康唑和伊曲康唑判定标准如下表所示。氟康唑的判定标准不适用于克柔念珠菌。采用不适当的溶媒溶解伊曲康唑可导致结果偏差。念珠菌体外药物敏感试验的结果判定标准敏感（S）剂量依赖敏感（S－DD）中度敏感（I）耐药（R）氟康唑≤816~32≥64伊曲康唑≤0.1250.25~0.5≥1氟胞嘧啶≤48~16≥32注