基因转殖技术原理

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1、基因轉殖技術原理I.基因轉殖技術的發展1974年，Jaenisch及Mintz發現：若將純化的SV40DNA注入老鼠的胚母細胞腔(blastocoelecavity)中，在該胚胎發育成鼠之後，可以在老鼠體組織中偵測到注入的DNA。由此可以推斷：注入的DNA可以插入胚胎細胞的染色體組(genome)內。 在1980，由Gordenetal.將HerpesSimplexVirus的thymidinekinase(TK)基因利用微量注射方式注入培養的纖維細胞(fibroblast)之細胞核中，發現約有5~20%的細胞含有

2、注入的基因且穩定表現該基因。同年，Gordenetal.發表了第一篇有關成功地經由微量注射將基因轉殖到老鼠體細胞中的研究報告。此方法將基因構築質體(geneticconstruct)微量注射到老鼠之授精卵中，然後將注射過的卵再送入假孕(pseudopregnant)母鼠體內。再確認所生出的小鼠後代是否正確地帶有植入的基因及其表現狀況。 這些技術被運用在特定的動物上，如：小鼠、大鼠、兔子、豬、羊以及牛。基因轉殖技術最主要的目的是發展出新的動物模式(animalmodels)。其最著名的例子便是囊性纖維病變(cysti

3、cfibrosis，CF)。 1981年，EvansandKaufmann及Martin兩個實驗室，將從囊胚(blastocyst)中的胚株母細胞(embryonicstemcells，EScells)利用在基因轉殖上。隨即，研究發現若將胚株母細胞利用微量注射方式注入囊胚中，並使之發育成鼠，則胚株母細胞便有能力發育成嵌合體老鼠(chimera)身上的任何一個組織，包括生殖細胞(germline)。 胚株母細胞的發現並將它當成基因傳到子代的媒介，尤其以基因標的(genetargeting)方面，已經在實驗方法上引起了

4、革命性的進步。基因轉殖技術的要件接著介紹的是有關會影響基因轉殖技術的重要動物變因 A.  動物無特殊病源株(specificpathogenfreecolony，SPFcolony) 維持SPF株的優點,簡述如下: 1.在繁殖(breeding)與存活(survival)方面：SPF動物較健康，活得較久，動物不致因感染而喪失。 2.在實驗方面：SPF品質減少了動物性的疾病，且提供了研究的可信度(reliability)與再現性(reproducibility)。 3.在基因型(genotype)方面：基因轉殖動物中

5、，被修改基因所產生的基因型，與環境間之相互作用往往是最無法預測的，而且容易由於不易繁殖而失去該動物株及相關研究，但SPF可以避免此類的問題。 4.在基因轉殖動物的運送方面：具SPF品質的基因轉殖動物可以直接運送到另一個無病源的場所(facility)，不需多花3-6個月的監測過程。5.在花費方面：將基因轉殖動物維持在無菌且避免感染的條件下所需花費較傳統方式來得昂貴，但若將可能因感染而失去基因轉殖動物株，或無法使實驗結果再現….等等後果考慮進去，則傳統方式有可能會花費較高。6.在野生囓齒動物方面：將基因轉殖動物飼養維

6、持在正壓的隔離盒(isolator)中或者SPF的保護中，可以避免基因轉殖動物與野生囓齒動物的接觸。相對地，若干維持SPF株的缺點，如： 1.方便性：取得SPF動物較不易且費時。 2.基本組織與建設(infrastructure)：SPF動物的飼養需要特殊的儀器設備，因此實驗進行會受限於SPF所需的環境。總括而論，SPF品質的基因轉殖動物需求量與日俱增。長遠來說，SPF品質的動物不必因為健康問題而被撲殺。 B.胚胎提供者的基因型(genotypeofthedonor) 為取得較大量的卵母細胞(oocyte)及胚胎(

7、embryo)，必須考慮下列幾項因素： (1)具有好的pluggingperformance及高精蟲數的male動物。 (2)動物必須對PMSG(PregnantMareSerumGonadotrophin)及hCG(humanChronicGonadotrophin)具可受性。 (3)具有足夠量的足齡動物可供使用。 C.受孕者(recipient)的基因型與衛生狀況隨機配種或F1雜交囓齒動物均是可以勝任的受孕者。某些母動物具有很大的壺腹(ampullae)以利胚胎植入，通常也具有十分良好的母性。若使用與胚胎相關的

8、F1雜交亞型(strain)會使得成功率提高。　如果在無菌狀態下植入胚胎，SPF級的受孕體必須被飼養在SPF條件下的飼養盒中，一旦小動物出生且離乳(weaning)之後，受孕母體則可拿來做微生物的檢測，以便提供新生鼠健康監測資料。轉殖技術:實驗方法 A.   微量注射(microinjection) 最常用來生產基因轉殖動物的方式為：直接把重組過的DNA注入