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《变性梯度凝胶电泳在微生物多样性分析中的应用及其技术发展》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、第30卷第3期东华理工学院学报Vol30No32007年9月JOURNALOFEASTCHINAINSTITUTEOFTECHNOLOGYSep.2007变性梯度凝胶电泳在微生物多样性分析中的应用及其技术发展徐玲玲,刘亚洁,李江,徐蔚云(东华理工大学,江西抚州344000)摘要:变性梯度凝胶电泳技术是目前研究微生物群落遗传多样性及种群动态性有效手段,已被广泛应用于土壤、活性污泥、生物膜、动物肠道、热泉、湖泊等环境微生物生态学研究。阐述了变性
2、梯度凝胶电泳的原理,分析其在微生物多样性分析方面的优越性及局限性;并着重介绍了PCR-DGGE应用过程中的技术发展,包括Cloning/DGGE,GC-DGGE,NestedPCR-DGGE和DG-DGGE。关键词:PCR-DGGE;Cloning/DGGE;GC-DGGE;NestedPCR-DGGE;DG-DGGE中图分类号:Q938文献标识码:A文章编号:1000-2251(2007)03-0279-04变性梯度凝胶电泳(Denaturinggradientgele-迁移,并逐区
3、域的解链,增大迁移阻力。当到达某lectrophoresis,DGGE)技术是目前研究微生物群落变性物质浓度,使DNA分子解链的程度合适,产生遗传多样性及种群动态性的有效手段。Fischer和的迁移阻力与电场力相平衡时,此DNA分子停留Lerman于1979年最先提出该技术,并应用于检测在这一变性浓度梯度的凝胶中,从而使序列组成不DNA突变(Muyzer,1998)。Muzyer(1993)等首次将同的DNA片断得到分离。DGGE技术应用于微生物生态学研究,并证实这种GC发夹结构是一个富含GC碱基
4、的序列,由技术在研究自然界微生物群落遗传多样性和种群于GC含量高,自身配对形成一种特殊的稳定结构,差异方面具有明显的优越性。在此后的时间里,该一般难以解链。在正向引物的5端`添加GC发夹结技术已被广泛应用于土壤、活性污泥、生物膜、动物构,通过PCR扩增中将其连接于DNA双链分子的肠道、热泉、湖泊等环境微生物生态学研究(王岳一端,使得该DNA难以完全解链成为两条单链坤,2005;宋业颖,2006;陈桐生,2006;柴丽红,DNA。单链DNA在DGGE中的电泳行为取决于2003)。DNA分子的大小,与
5、DNA的碱基排列无关,所以长度相同的双链DNA在DGGE中解链成长度相同的1基本原理单链DNA,它们具有相似的电泳行为,在DGGE中PCR-DGGE是一项基于PCR技术的分子生物不能被完全分开。GC发夹结构的引入使DGGE电学方法,用于分离大小相近的DNA片段。由于泳分析结果更加深入细致(Muzyer,1993;罗海峰,DNA序列中G,C,A,T四种碱基组成和排列差异,2003)。使双链DNA分子具有不同的解链温度(Tm)。理论上认为,只要选择的电泳条件如变性剂梯PCR-DGGE利用尿素和甲酰胺
6、两种变性物质制成度、电泳时间、电压等足够精细,有一个碱基差异的由低到高浓度的变性梯度凝胶,在电泳过程中使双DNA片段都可被分开。链DNA在化学变性剂的作用下解链。低Tm的2PCR-DGGE技术的优越性DNA会在低浓度的变性物质作用下形成部分单链,而高Tm的DNA则在高浓度的变性物质作用下解2.1检测极限低链。电泳过程中双链DNA分子在变性梯度凝胶上Muyzer等(1993)用这种方法能检测出数量仅收稿日期:2007-04-26占总群落数1%的微生物。Omar等(2000)证实基金项目:国家自然
7、基金项目资助(30570016)PCR-DGGE技术检测极限大约为1%~3%,如果结作者简介:徐玲玲(1980),女,黑龙江佳木斯人,硕士生,主要从事环境生物技术研究。合使用rRNA杂交技术,还可使检测极限降至280东华理工学院学报2007年01%左右。在实验中发现扩增的PCR产物在DGGE图谱中可2.2检测速度快、经济能出现同一条带中含有不同种类的细菌。如果电泳条件不适宜,也不能保证将有一定序列差异的Omar等(2000)利用该方法实时
8、实地的研究了DNA片段完全分开。墨西哥发酵玉米面团Pozol在发酵过程中不同阶段(4)不能提供在某一环境中微生物的真实图微生物种类和数量发生了动态变化。Cocolin等景,无法给出群落代谢活性、细菌数量和基因表达(2001)对意大利香肠发酵动力学变化进行了研究,水平的信息,因此需要结合荧光原位杂交(FISH)PCR-DGGE方法能在取样后8h内得到结果,能够和微电极测量技术等方法以便更详尽地分析微生实时监测发酵状态,因此可以根据生产的实际需要物群落的复杂性。曾薇(2006)等人采用
