变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用

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1、变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用【关键词】变性梯度凝胶电泳；法医学应用 【中图分类号】R919．2 【文献标识码】B 　　【文章编号】1007—9297(XX)02—0063—04 　　随着人类基因组计划的实施和迅速发展．人类基 　　因的神秘面纱已逐步揭开，越来越多的疾病或基因多 　　样性均与基因的突变有关。因此，对基因突变的筛选 　　或诊断无论对基础研究还是临床研究均具有重要意 　　义。近年来，一系列新的基因突变检测方法层出不穷 　　的同时，经典的方法也不断得到改进。其中。由Fischer 　　和Lerm

2、an[，2】创立的变性梯度凝胶电泳(denaturinggra— 　　dientgelelectrophoresis，DGGE)历经多次改良，已发 　　展成一类极具实用价值的常规突变检测技术．被广泛 　　应用于疾病的诊断或相关基因的筛查、人类基因多态 性分析、微生物种群研究等各个领域。 一 、DGGE基本原理 　　DGGE是利用DNA的物理性质进行突变分析的。 　　其原理是基于待测DNA片段双螺旋的解链温度 　　(meltingtemperature。Tm)。Tm值由DNA片段的碱基 　　数目和碱基组成共同决定

3、。主要引起低温解链区域解 　　链。当DNA片段在变性剂(尿素和甲酰胺)浓度呈线 　　性梯度增加的凝胶中电泳时。起初双螺旋DNA片段 　　以恒定的速率(由分子量决定)向前迁移，在抵达变性 　　效果相当于其Tm值的变性剂浓度点时．双链DNA开 　　始部分解链．部分解链后的DNA分子呈分枝状使其 　　迁移速度极度减缓．几乎处于“停顿”状态。长度相同 　　但序列不同的DNA片段。即使仅存在单个碱基改变。 　　也将影响邻近碱基间的相互作用．导致Tm值的改变． 　　从而在不同的变性剂浓度点解链、“停顿”．这样DNA 　　片

4、段由于相同电泳时间内的不同位移而得以分离。 　　上述原理仅能检测DNA片段中低温解链区存在 　　的序列差异或突变．而位于高温解链区的则无法检 　　出．因高温解链区解链的变性条件可使整个双链完全 　　解开导致序列依赖的凝胶迁移特性丧失。基于此．可 　　通过克隆或PCR方法在待检目的片段的5端引入 　　3O5O个GC碱基组成的寡核苷酸链．即GC—Clamp。 　　使其成为片段中Tm最高的区域，从而使目的片段高 　　温解链区解链时DNA双螺旋不至于完全解链成单 链，极大增加DGGE的突变检出率。[3] 　　变性梯度凝

5、胶是有方向性的，据此可将DGGE分 　　为两类：垂直DGGE和平行DGGE。垂直DGGE的变 　　性剂梯度方向与电泳方向垂直，可用于确定同一DNA 　　片段上不同的解链区域、优化样本的分离条件或分析 　　PCR产物的组成；平行DGGE的变性剂梯度方向与电 　　泳方向一致，在所检测的DNA解链区域和温度已知 的情况下可用于多个样本的同时分析。 二、DGGE衍生技术 圈It曩 　　(一)恒定变性凝胶电泳(constantdenaturantgel 　　electrophoresis，CDGE) 　　由Hovig等嗍

6、(1991年)在DGGE的基础上发展 　　而来．它是通过预试验或理论计算预先精确确定待测 　　DNA片段的Tm值后即采用相当于该Tm值的单一变 　　性剂浓度的凝胶电泳．使不同的DNA片段各自以不 　　同但恒定的速度迁移。CDGE避免了化学变性剂梯度 　　的应用．且选择特定的最佳变性剂浓度可获得最好的 　　分辨效果。同时克服了DGGE电泳时间长的缺点，使 　　其变得更加简单快速。但对含有多个解链区域的目的 　　片段需选择不同浓度的变性凝胶以提高检测效率。因 　　需事先精确确定待测片段的Tm值。故该法主要用于 已知

7、突变的检测。 　　【基金项目l国家自然科学基金资助(No．30300399) 　　【作者简介l黄代新(1969一)，男，湖北松滋人，博士，副教授，主要从事法医分子遗传学研究。 ·146· 　　(二)温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgel 　　electrophoresis，TGGE) 　　TGGE凝胶中含有固定浓度的化学变性剂，在电 　　泳过程中．通过微处理器控制从凝胶的顶端到底端形 　　成一线性增加的温度梯度，以此取代DGGE中的化学 　　变性剂浓度梯度。变性环境由凝胶中恒定浓度的变性

8、 　　剂和温度梯度共同构成。[5,61由于无需制备变性梯度 　　胶，TGGE较DGGE更加简单稳定。但目前大多TGGE 　　仪器所允许的温度范围为15℃～80℃，较大片段的 　　Tm值会因接近8O℃从而增加了检测的困难。 　　(三)瞬时温度梯度凝胶电泳(temporaltempera— 　　turegradientgelelectrophoresis，TTGE) 　　由日本学者Yosh