变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用.docx

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1、变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用【关键词】变性梯度凝胶电泳；法医学应用【中图分类号】r919．2【文献标识码】b【文章编号】1007—9297(20xx)02—0063—04随着人类基因组计划的实施和迅速发展．人类基因的神秘面纱已逐步揭开，越来越多的疾病或基因多样性均与基因的突变有关。因此，对基因突变的筛选或诊断无论对基础研究还是临床研究均具有重要意义。近年来，一系列新的基因突变检测方法层出不穷的同时，经典的方法也不断得到改进。其中。由fischer和lerman[，2】创立的变性梯度

2、凝胶电泳(denaturinggra—dientgelelectrophoresis，dgge)历经多次改良，已发展成一类极具实用价值的常规突变检测技术．被广泛应用于疾病的诊断或相关基因的筛查、人类基因多态性分析、微生物种群研究等各个领域。一、dgge基本原理dgge是利用dna的物理性质进行突变分析的。其原理是基于待测dna片段双螺旋的解链温度(meltingtemperature。tm)。tm值由dna片段的碱基数目和碱基组成共同决定。主要引起低温解链区域解链。当dna片段在变性剂(尿素和甲酰胺)浓度呈线性梯度增加的凝胶

3、中电泳时。起初双螺旋dna片段以恒定的速率(由分子量决定)向前迁移，在抵达变性效果相当于其tm值的变性剂浓度点时．双链dna开始部分解链．部分解链后的dna分子呈分枝状使其迁移速度极度减缓．几乎处于“停顿”状态。长度相同但序列不同的dna片段。即使仅存在单个碱基改变。也将影响邻近碱基间的相互作用．导致tm值的改变．从而在不同的变性剂浓度点解链、“停顿”．这样dna片段由于相同电泳时间内的不同位移而得以分离。上述原理仅能检测dna片段中低温解链区存在的序列差异或突变．而位于高温解链区的则无法检出．因高温解链区解链的变性条件可使

4、整个双链完全解开导致序列依赖的凝胶迁移特性丧失。基于此．可通过克隆或pcr方法在待检目的片段的5端引入3o5o个gc碱基组成的寡核苷酸链．即gc—clamp。使其成为片段中tm最高的区域，从而使目的片段高温解链区解链时dna双螺旋不至于完全解链成单--来源网络整理，仅供学习参考链，极大增加dgge的突变检出率。[3]变性梯度凝胶是有方向性的，据此可将dgge分为两类：垂直dgge和平行dgge。垂直dgge的变性剂梯度方向与电泳方向垂直，可用于确定同一dna片段上不同的解链区域、优化样本的分离条件或分析pcr产物的组成；平行

5、dgge的变性剂梯度方向与电泳方向一致，在所检测的dna解链区域和温度已知的情况下可用于多个样本的同时分析。二、dgge衍生技术圈it曩(一)恒定变性凝胶电泳(constantdenaturantgelelectrophoresis，cdge)由hovig等嗍(1991年)在dgge的基础上发展而来．它是通过预试验或理论计算预先精确确定待测dna片段的tm值后即采用相当于该tm值的单一变性剂浓度的凝胶电泳．使不同的dna片段各自以不同但恒定的速度迁移。cdge避免了化学变性剂梯度的应用．且选择特定的最佳变性剂浓度可获得最好的

6、分辨效果。同时克服了dgge电泳时间长的缺点，使其变得更加简单快速。但对含有多个解链区域的目的片段需选择不同浓度的变性凝胶以提高检测效率。因需事先精确确定待测片段的tm值。故该法主要用于已知突变的检测。【基金项目l国家自然科学基金资助(no．30300399)【作者简介l黄代新(1969一)，男，湖北松滋人，博士，副教授，主要从事法医分子遗传学研究。·146·(二)温度梯度凝胶电泳(temperaturegradientgelelectrophoresis，tgge)tgge凝胶中含有固定浓度的化学变性剂，在电泳过程中．通过

7、微处理器控制从凝胶的顶端到底端形成一线性增加的温度梯度，以此取代dgge中的化学变性剂浓度梯度。变性环境由凝胶中恒定浓度的变性剂和温度梯度共同构成。[5,61由于无需制备变性梯度胶，tgge较dgge更加简单稳定。但目前大多tgge仪器所允许的温度范围为15℃～80℃，较大片段的tm值会因接变性梯度凝胶电泳及其在法医学中的应用第2页近8o℃从而增加了检测的困难。(三)瞬时温度梯度凝胶电泳(temporaltempera—turegradientgelelectrophoresis，ttge)由日本学者yoshino等同于19

8、91年建立．最初称为温度掠扫凝胶电泳(temperaturesweepgelelectrophoresis，tsge)，后改称为tyge。其原理类似于tgge，是在加有一定浓度化学变性剂的聚丙烯酰胺凝胶电泳过程--来源网络整理，仅供学习参考中，使凝胶板的温度以恒定速度逐渐升高，从而在跑胶的