高效液相色谱法测定猪血清中的依维菌素

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1、以诚为本、品质第一、顾客第一、信誉第一高效液相色谱法测定猪血清中的依维菌素　　猪血又称液体肉、血豆腐和血花等，味甘、苦，性温，有解毒清肠、补血美容的功效。猪血富含维生素B2、维生素C、蛋白质、铁、磷、钙、尼克酸等营养成分。　　建立猪血清中依维菌素(ivermectin)的高效液相色谱测定方法。方法：以0。05偏磷酸-甲醇(7：3)沉淀猪血清蛋白后用乙酸乙酯提取依维菌素，离心后取上清液用旋转真空蒸发器挥干溶剂，用甲醇溶解残渣后进样分析。色谱柱为反相柱(5μm，250mm×4.6mm)，流动相为甲醇-水(90：10)，流速1ml/min，紫外检测波长为

2、245nm结果方法检出下限为0.010mg/L，线性范围为0.010～20mg/L，相对标准差为0.78%～3.82%，加标回收率为94.0%～100.O%。结论本法操作简便，结果准确可靠，适用于猪血清中微量依维菌素的测定。　　「关键词」高效液相色谱法;猪血清;依维菌素　　依维菌素是一种新型高效广谱抗寄生虫药，对线虫、昆虫和螨虫等均有驱杀作用，可用于防治家畜和宠物的寄生虫病。其在体内有一定的蓄积性，人食用了这些家畜肉制品后，依维菌素会对人体健康产生危害。因此，需测定动物血清中依维菌素的含量。对于基体简单的样品如药片和注射液中依维菌素含量的测定可用紫

3、外分光光度法和高效液相色谱法。血清样品基体复杂，干扰成分多，其测定相对困难，国外已有荧光衍生-HPLC法的报道，该法灵敏度高，但衍生化步骤繁琐，分析成本较高。本研究利用0.05%偏磷酸-甲醇(7：3，V/V)沉淀血清蛋白、乙酸乙酯提取其中微量依维菌素，高效液相色谱法测定含量，取得了较为满意的结果。　　1材料与方法　　1。1主要试剂及仪器　　甲醇(色谱纯);乙酸乙酯(分析纯);偏磷酸(分析纯);依维菌素标准储备液：准确称取0.0500g依维菌素(中国兽药监察所提供，批号KY31297)于25ml容量瓶中，加甲醇溶解定容，此液质量浓度为2.00mg/m

4、l。临用前，用甲醇稀释成应用液。本实验用水均为纯水。　　液相色谱仪;反相色谱柱：5μm，250mm×4.6mm;色谱保护柱;紫外可见分光光度计;离心机;旋转真空蒸发器。广州市深华生物技术有限公司以诚为本、品质第一、顾客第一、信誉第一　　1。2实验方法　　1。2。1色谱条件流动相：甲醇-水(90：1O)，流速1ml/min，柱温25℃，反相C18色谱柱(5μm，250mm×4.6mm)分离，紫外检测波长为245nm。　　1。2。2标准曲线绘制取依维菌素标准应用液用甲醇稀释成0.10mg/L，0.25mg/L，0.50mg/L，1.O0mg/L，2.5

5、0mg/L，在仪器基线达到平直后，分别进样20μl。依维菌素保留时间为17.0min左右。以进样量(X，ng)为横坐标，峰面积(Y)为纵坐标，计算线性回归方程。本标准曲线回归方程为Y=1.75X一0.12，r=0.9994。　　1。2。3样品处理及测定取猪血清1.00ml置于10ml离心管中，加0.05%偏磷酸-甲醇(7：3，V/V)1.00ml，漩涡混匀，加4.00ml乙酸乙酯振摇200次提取，4000r/min离心5min。吸取乙酸乙酯层3.O0ml于10ml离心管中，于40℃水浴下用旋转真空蒸发器挥干。加0.20ml甲醇旋涡振荡1min并超声

6、1min溶解，4000r/min离心5min后取上清液进样100μl。　　2结果与讨论　　2。1色谱条件的优化　　2。1。1检测波长的选择在200nm～400nm范围内，用UV-260紫外可见分光光度计对依维菌素进行紫外扫描，其在245nm及238nm均有峰值吸收，本法选择245nm为检测波长。　　2。1。2流动相中甲醇比例的选择改变流动相中甲醇与水的比例，观察保留时间及峰形的变化。实验结果表明，流动相中甲醇含量对依维菌素保留时间影响较大。甲醇含量从100%变化为90%时，保留时间从4.9min变化为17.0min。17.0min时可将依维菌素与血

7、清中杂质基本分离。所以，本法选用甲醇-水(90：10)为流动相。　　2。1。3柱温的选择柱温影响待测物质与流动相、固定相之间的分配、吸附，也影响流动相的粘度，进　　而影响保留时间和峰形。比较了柱温为20℃、25℃、30℃广州市深华生物技术有限公司以诚为本、品质第一、顾客第一、信誉第一时的依维菌素的出峰时间及峰形，结果无明显差别。本法选用柱温为25℃。　　2。2样品提取条件的优化　　2。2。1提取溶剂的选择从依维菌素的分子式可以看出它是相对分子质量大、极性小的化合物，应选用极性小的有机溶剂进行提取。实验结果表明，在相同的条件下，乙酸乙酯的提取效率为9

8、4.3%;二氯甲烷的提取效率为26.7%。正己烷、乙醚的提取效率为74.0%。故选用乙酸乙酯作为提取剂。2.00ml乙酸乙