多杀菌素的高效液相色谱法测定

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1、多杀菌素的高效液相色谱法测定农药第42卷第10-~(2003)27多杀菌素的高效液相色谱法测定张苑,金志华,林建平,Wr沛霖(浙江大学材料与化工学院生物工程研究所.杭州310027)摘要采用高效液相色谱法对Sacvharpolysporasg.,,su发酵液中多杀茸素含量进行测定.本方法的相对标准偏差为0.11%.变异系数为0.15%.线性相关系数为0.99916.平均回收率为96.94%.关键词多杀茵素高效液相色谱分析多杀菌素是由刺糖多孢菌(Saccharpol~pora,脚)产生的大环内酯类生物杀虫剂【】J.它具有高效,低毒,对环境友好等优点,是一种绿色广谱杀虫剂.兼具生物农药的安

2、全性和化学合成农药的快速效果【3.4】.本文采用高效液相色谱法对S.spinosa发酵液中多杀菌素含量进行了定量分析,该方法快速,准确,重复性好,适合于发酵液中多杀菌素含量的测定,也可用于产品质量控制.1仪器和试剂1.1仪器Agilend1100高效液相色谱仪;pH计PHS一25数显(0.01级)(上海雷磁精密仪器厂);电子天平(BP190SMax200gd=0.1mg);台式离心机TDL80—2B(上海安亭科学仪器厂);超声波清洗器;微孔滤膜(F型0.45/~m,天津自动科学仪器公司).1.2试剂甲醇(色谱纯,上海化学试剂研究所);乙腈(色谱纯.中国医药集团上海化学试剂公司);超滤水

3、(自制);多杀菌素标准品(含量≥99%)o2色谱工作条件色谱柱:Agilend0213Nucleosil100—5C185/zm,250×4.0mm;检测器:紫外光度检测器.波长250nm;流动相:甲醇/乙腈/水=45/45/10(v/v),含有0.05%的乙酸钠:流速:1.0ml/min;进样量:20~1;柱温:室温.3实验方法3.1标准溶液的配制准确称取多杀菌素标样0.025g,加入10ml甲醇.并反复振荡,使标样完全溶解,离心.上清液用0.45/~m的滤纸过滤,即可用于HPLC测定.3.2试样溶液的配制取1Oral发酵液样离心,弃去上清液,向沉淀中添加10ml甲醇.并反复振荡.使

4、多杀菌素完全溶解..再次离心,用0.45/zm的滤纸过滤上清液.即可用于HPLC测定.3.3测定方法在上述色谱工作条件下.待仪器基线稳定后,连续注入数针标准溶液.计算各针相对响应值的重复性.待相邻两针的响应值变化小于1.5%后.按照标准溶液,样品溶液,样品溶液,标准溶液的顺序进行高效液相色谱分析.采用外标法对样品进行定量分析.多杀菌素含量(mg/I)按下列公式进行计算:x:^J×P,12式中:A.为标准溶液中多杀菌素的峰面积平均值A:为样品溶液中多杀菌素的峰面积平均值P为标样中多杀菌素的含量(mg/l)4结果与讨论4.1色谱条件的确定据文献报道【?和实验对比筛选,确定了检测波长,流动相

5、配比,色谱柱,流速等条件.在此条件下能快速,灵敏,准确地进行定量分析,标样和发酵液样品的HPLC图见图1和图2.(多杀菌素A的出峰时间为9.389min,多杀菌素D的出峰时间为10.940min)图1多杀菌素标样膏效液相色谱图(多杀菌素A的出峰时问为9.403rain,多杀菌素D的出峰时间为10.972min)图2多杀菌素发酵液膏效液相色谱图28PESTICIDESV01.42No.10(2003)4.2分析方法的线性相关性测定多杀菌素标准品分别配制成50,125,250,500,1000,1250rag/L六种不同浓度的标准溶液,在要求的色谱条件下进行相同体积的进样,以浓度为横坐标,

6、峰面积为纵坐标作图可得一直线(图3).考察峰面积Area(mAU*rain)与浓度Amt(mg/l)的关系.从图3得到多杀菌素HPIC分析法的回归方程Area=15.481*Amt+321.7,相关系数r=0,99916.多杀菌素浓度在50～1250mg/1.范围内,峰面积与多杀菌素浓度之间都有良好的线性相关性.mAU★m;n20000l50001000050000050010001500mg/I图3多杀菌素HPIC分析法峰面积与多杀菌素含量线性相关性曲线4.3分析方法的精密度测定以处理好的发酵液为样品,用本方法进行六次重复测定,结果多杀菌素HPI.C分析法的相对偏差为0.11%,变异

7、系数为0.15%,说明本方法的重复性良好.'4.4分析方法的准确度测定采用标准添加法,在已知含量的样品中添加?一定量的已知标准品,在上述液相色谱条件下进行6次重复测定,测得平均回收率为96.94%.参考文献(1]KirstHA.MichelKH,MynderseJS.a1.Discovery.isolation.andstructureelucidationofafamilyofstr~cturaUyunique.fer.mentation—d