反相高效液相色谱法检测鲫鱼肌肉中伊维菌素论文

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1、反相高效液相色谱法检测鲫鱼肌肉中伊维菌素论文【摘要】以鲫鱼肌肉为材料，建立了一种简便、准确的反相高效液相色谱法，用于鱼肉中伊维菌素的药物残留检测和药代动力学研究。鲫鱼肌肉中的伊维菌素用乙酸乙酯提取，离心后的上清液于45℃下氮气吹干，残渣用甲醇水(4∶1，V/V)混合液溶解，正己烷去脂，离心后取下清液.freelectin，IVM)为阿维菌素的衍生物，是目前最优秀的广谱抗寄生虫药之一，具有广谱、高效、用量小、安全等优点，对生物体内外寄生虫，特别是线虫和节肢动物均有高效驱杀作用。1981年投入市场后，在临床兽医中得到了广泛应用。而其在水产养殖寄生虫病害防治方面的应用也

2、引起了人们的关注。目前，动物体内伊维菌素残留的检测方法主要有HPLCUV检测法1和HPLC荧光检测法2,3。但这些方法多为家畜样品的药物残留检测，对鱼体内IVM的测定方法研究甚少。Pantelis等4利用酶联免疫吸附测定法(ELISA法)测定了IVM在海鲷内的含量;Zhang等5利用液相色谱串联质谱法测定了鳗鱼体内IVM的残留量;赵思俊等6采用HPLC法检测动物肌肉中多种药物残留;沈金灿等7采用HPLCMS法检测动物肌肉中兽药残留。这些方法各具优缺点，样品前处理过程均较复杂，且耗时。本研究以鲫鱼为实验对象，对肌肉样品的前处理过程进行了优化，采用反相高效液相色谱

3、法分析了鲫鱼肌肉中IVM的残留量。研究结果可为鱼体肌肉组织中IVM的残留检测及药代动力学研究提供参考。2实验部分2.1仪器与试剂SHIMADZU高效液相色谱仪(HPLC)，配有SPD20A紫外检测器;SupRa22K冷冻离心机;QGC24T氮气吹干仪;FSH2匀浆机;SK2200L超声波仪;H101漩涡混合器。伊维菌素标准品(Sigma公司);甲醇(色谱纯，Merck公司);乙酸乙酯(色谱纯，Urchem公司);正己烷与无水Na2SO4均为分析纯(国药公司);水为MilliQ超纯水。2.2实验方法2.2.1色谱条件VPODSC18色谱柱(150mm×4

4、.6mm，5μm)。流动相为甲醇水(90∶10，V/V)，流速1.0mL/min。柱温为25℃;紫外检测波长为245nm;进样量20μL。2.2.2标准溶液的配制准确称取50mg伊维菌素标准品于50mL棕色容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀即得1g/L的标准储备液。精确量取1mL标准储备液于100mL棕色容量瓶中，用甲醇稀释至刻度，即得10mg/L的标准A溶液。精确量取标准A溶液适量，用甲醇稀释成质量浓度分别为0.025,0.05,0.10,0.25,0.50,1.00和2.50mg/L的系列标准工作液。2.2.3样品的处理称取鲫鱼肌肉组织(1.0000±0.

5、0010)g于10mL烧杯中，剪碎后加少许无水Na2SO4和3mL乙酸乙酯，以10000r/min匀浆30s，将匀浆液倒入10mL尖底玻璃离心管A中，以3mL乙酸乙酯洗涤刀头和小烧杯，将洗涤液全部倒入A管，超声提取10min，以5000r/min离心8min，将上清液倒入另一支10mL尖底玻璃离心管B中，A管残余物再用5mL乙酸乙酯提取一次，涡旋振荡30s，超声，离心后，合并上清液于B管中，在45℃用氮气将B管提取液吹干后，向B管中加入1mL甲醇水(4∶1，V/V)混合液，超声5min使残渣完全溶解，再加入1mL正己烷，涡旋振荡30s，3000r/min离心3mi

6、n，取下清液1mL，以0.22μm微孔滤膜过滤，取滤液进行RPHPLC检测。3结果与讨论3.1样品处理方法的选择和色谱分析条件的优化3.1.1提取剂的选择自生物样品中提取IVM的常用提取剂有乙腈、乙酸乙酯和甲醇。通过标准加入实验，测得3种提取剂的平均绝对回收率分别为90.5%,95.9%和83.1%。甲醇提取的回收率最低，且提取物杂质多，对IVM峰的干扰很大。乙酸乙酯和乙腈提取IVM时，基质背景相对干净，IVM峰两边基线平稳，分离效果很好。由于乙酸乙酯提取的回收率最高，且比乙腈更易以氮气吹干，因此选用乙酸乙酯为提取剂。3.1.2去脂过程的处理本实验用正己烷去脂，但

7、正己烷与甲醇部分互溶，因此，前处理过程中，氮气吹干后的残渣不能直接加甲醇溶解定容。实验发现，甲醇水(4∶1，V/V)混合液能很好地溶解残渣，且与正己烷不互溶。因此，氮气吹干后的残渣用甲醇水(4∶1，V/V)混合液溶解定容。3.1.3流动相的选择当流动相中甲醇与水的比例分别为100∶0,93∶7,91∶9和90∶10时，IVM的出峰时间分别为3.5,8.1,9.5和13.1min。实验表明，当用甲醇水(90∶10，V/V)为流动相时，IVM与杂质分离良好，基线平稳，左右无干扰峰。提高流动相中甲醇的比例会使IVM出峰时间提前，IVM还未与杂质完全分离就出峰，将