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1、蛋清卵类粘蛋白的分离纯化一．实验器材1.仪器：pH计、恒温磁力搅拌器、蛋白质核酸分析仪、自动部份收集器、梯度混合器、层析柱、紫外可见光分光光度计、真空冷冻干燥机、电泳仪、电泳槽、恒温震荡摇床、透析袋、冷冻离心机、真空干燥箱、分析天平2.试剂：新鲜鸡蛋、SephadexG-25凝胶填料、DEAE-32纤维素离子交换填料、卵类粘蛋白标品、三氯乙酸(TCA)、丙酮、氯化钠、NaH2P04、Na2HP04、考马斯亮蓝G-250、考马斯亮蓝R-250、丙烯酰氨、过硫酸胺、甘氨酸、Tris-base、十二烧基硫酸钠、乙醇
2、、冰醋酸、碳酸氧钠、氯化铁、硫酸胺3.主要溶液的配制及材料的处理：10%三氯醋酸(pH1.15):先把称好的TCA加总体积2/3的水溶解,再用10mol/LNaOH调节pH至1.15,最后加水至所需体积。0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液:先配成10倍的母液,用时稀释至0.02mol/L;磷酸氧二钠-磷酸二氧钠缓冲液(0.02mol/L,pH6.5,25℃）配制方法:0.2mol/L磷酸氢二钠:Na2HP0412H2071.64g/1000mL,31.5mL;0.2mol/L磷酸二氧钠:NaH2P042
3、H2031.21g/1000mL,68.5mL;胰蛋白酶标准液(0.5mg/mL):用0.001mol/LHCl配制(每次50ml,用完再配);BAEE底物缓冲液(内含0.05mol/LCaCb):用0.05mol/L的Tris-HCl溶解,调pH至7.8;1mmol/LBAEE底物溶液:34mgBAEE定容至100mL底物缓冲液中,临用前配置。SephadexG-25葡聚糖凝胶层析填料的处理:称取30gSephadexG-25,用0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液500mL热溶胀2h或者室温溶胀24h
4、。脱气后装柱。DEAE-32纤维素离子交换填料的处理:称取DEAE-纤维素粉(DE-32)10g,以150mL0.5mol/LNaOH-0.5mol/LNaCl溶液浸泡20min,转移到布氏漏斗中抽滤,用蒸馏水洗至中性(大约pH8.0),抽去水分,移至烧杯中,再用150mL0.5mol/LHCl浸泡20min,然后移至布氏漏斗中抽滤,以蒸馈水洗至中性(大约pH6.0)。最后倒在烧杯中用150mL0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液浸泡片刻。于真空干燥器内脱气,装柱。二．实验方法1.CHOM粗品的制备1.1
5、TCA沉淀杂蛋白取50mL鸡蛋清,加等体积的10%三氯醋酸(pH1.15)溶液,这时出现大量的白色沉淀,搅拌均匀后在pH酸度计上检查pH值,此时的pH值应是3.5。若提取液的pH值偏离pH3.5±0.2,则要用5mol/LNaOH或5mol/LHCl把pH值调回到pH3.5±0.2的范围以内。由于提取液非常粘调,要防止局部过酸或过碱。调好pH值后,在室温下静置4h以上。1.2离心去除杂蛋白沉淀待清蛋白完全沉淀后,以3000r/min离心10min。弃去沉淀物,上清再用滤纸过滤。以滤除上清液中的脂类物质及其他不
6、溶性物质。1.3冷丙酮沉淀CHOM粗品收集滤液转移到一个烧杯里。检查滤液的pH值是否是pH3.5,若相差较大要调回到pH3.5。放置冰浴中冷却片刻,缓慢加入3倍体积的预冷丙酮(放在冰箱的冷藏室预冷)。用玻璃棒轻轻揽匀。用塑料薄膜盖好,尽量减少丙酮的挥发。在冰浴里放置4h以上。1.4离心收集CHOM粗品并除残留丙酮待CHOM完全沉淀后,以4000r/min离心5min,倾出上清夜。将沉淀物放在真空干燥器类,抽气除去残留丙酮。然后用20mL蒸馏水溶解(若溶解液浑油,则用滤纸除去不溶物),即得CHOM粗提液。2.S
7、ephadexG-25层析柱脱盐取20mLCHOM粗提液上柱脱盐(上样量不超过柱床体积的1/6)。用0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液平衡并洗脱。收集洗脱峰。3.DEAE-32纤维素离子交换法纯化CHOM将经SephadexG-25脱盐的CHOM粗提液上柱吸附。用0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液淋洗去除杂蛋白。流出液在核酸蛋白检测仪上绘出稳定的基线。然后改用0.3mol/LNaCl-0.02mol/L,pH6.5磷酸缓冲液洗脱。并收集活性峰。4.CHOM纯品的制备4.1透析除盐将上述收集到的溶液
8、全部装入透析袋内。用蒸馏水进行透析。间隔一段时间更换一次蒸傾水,直到用l%AgN03检查无氯离子为止。4.2调整透析液的pH及冷丙酮沉淀CHOM纯品将透析液转移到烧杯里,用1mol/LHC1调节至pH4.0,然后加入3倍体积的预冷丙酮。盖上塑料薄膜,在冰浴里静置4h以上。4.3CHOM纯品的离心和干燥待CHOM全部析出后,倾出上清,剩余的沉淀物于4000r/min离心5min。弃去上清夜,沉淀物干燥
